靜原雞let-7a-5p的靶基因預測及組織表達分析

鄧占釗，禹保軍，曹國偉，張 娟，石永宏，胡偉龍，仇秀玲

(1.彭陽縣畜牧技術推廣服務中心，固原 756599；2.寧夏大學農學院，銀川 750021；3.寧夏九三零生態農牧有限公司，銀川 750021)

隨著家禽育種工作對生長速度的高強度選擇，快大型育肥雞生長至42日齡時體重可達2.5 kg以上[1]。盡管肉雞具有較高的生長速度和產肉性能，但其肉品質量卻顯著下降，尤其肉品風味下降較快[2]。因此，在禽類生長速度提高的前提下，改善肉質風味，培育肉質優良、風味獨特的優質地方雞種成為現代畜禽分子育種的主要研究方向。在各種肉類產品中，雞肉因其高蛋白、低脂肪和低膽固醇的特性成為當前消費者營養補給的重要食品。靜原雞作為優良的地方雞種，個體小、生長速度慢，肌肉內肌苷酸(IMP)含量高[3]，是肌肉品質研究的理想動物模型。

microRNA(miRNA)是一類小的單鏈內源性非編碼RNA，長度為17～24 nt[4]。miRNA主要通過介導RNA誘導沉默復合體(RISC)結合靶基因從而調節基因的表達及穩定性[5]，其作為一種在物種間高度保守的短鏈非編碼RNA，主要通過翻譯抑制或使mRNA降解來調節基因表達[6]。當前關于miRNA對肉品質的調控研究主要集中在其對骨骼肌發育調控[7]、肉質形成[8]、不同肌肉類型形成[9-11]、不同體組織形成[12]、不同處理后影響[13]等方面。研究證實，let-7a在動物生長發育、細胞分化與凋亡等方面發揮著重要的調控作用[14-16]。實驗室前期通過轉錄組測序發現，let-7a-5p在靜原雞胸肌和腿肌組織中高度表達，且在胸肌中表達水平顯著高于腿肌[17]，推測let-7a-5p可能參與調節靜原雞肌肉發育及肉品質。鑒于此，本試驗通過成熟序列比對、靶基因功能注釋及靜原雞各組織表達譜分析，探討let-7a-5p在靜原雞肌肉組織中的功能作用，以期為進一步探究let-7a-5p的功能和作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

采集180日齡靜原雞公雞和母雞的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸肌和腿肌組織，用手術剪快速分離成黃豆大小，放入凍存管投入到液氮罐中，帶回實驗室于―80 ℃保存備用。

1.2 方法

1.2.1 let-7a-5p序列比對及保守性分析 從已驗證的miRNA-Seq結果中篩選出差異表達的let-7a-5p，其測序獲得的成熟序列為：5′-UGAGGUAG-UAGGUUGUAUAGUU-3′。在miRbase(http:∥www.mirbase.org/)數據庫中下載人(Homosapiens，hsa)、小鼠(Musmusculus，mmu)、大鼠(Rattusnorvegicus，rno)、獼猴(Macacamulatta，mml)、牛(Bostaurus，bta)、原雞(Gallusgallus，gga)、鱈魚(Gadusmorhua，gmo)和山羊(Caprahircus，chi)的let-7a-5p成熟序列(表1)。利用Mega 7.0軟件將miRNA-Seq中獲得的let-7a-5p的成熟序列與上述8個物種進行比對，分析其物種間保守性。

1.2.2 let-7a-5p靶基因預測 將let-7a-5p信息提交在線軟件miRanda (https:∥www.miranda.org/)、TargetScan (http:∥www.targetscan.org/)和miRDB (http:∥mirdb.org/miRDB/)預測靶基因，三者交集組成的基因集合可進行后續分析。

1.2.3 let-7a-5p靶基因功能富集分析 使用在線數據庫DAVID(https:∥david.ncifcrf.gov/)對靶基因集合進行GO功能和KEGG通路富集分析，以P<0.05為閾值定義靶基因顯著富集的GO條目和KEGG通路。

1.2.4 let-7a-5p與靶基因互作網絡分析 利用Cytoscape軟件繪制let-7a-5p與靶基因的調控網絡。

1.2.5 組織表達分析 使用RNAiso Plus試劑(Code No.D9108A)提取靜原雞心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸肌和腿肌組織總RNA，按照反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real-time)(TaRaKa公司)說明書反轉錄為cDNA，―20 ℃保存備用。采用莖環法設計let-7a-5p的反轉錄引物(RT)和特異性定量引物，以U6為內參，引物序列見表2。使用QuantiNovaTMSYBR?Green PCR試劑盒(QIAGEN公司)在CFX系統中進行實時熒光定量PCR檢測。PCR反應體系10 μL：SYBR Green 5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3 μL。PCR反應程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，共39個循環；熔解曲線分析：60～95 ℃ 4 s。每個樣本3個重復。

表2 引物信息Table 2 Primer information

1.2.6 數據處理 利用2―ΔΔCt計算各個樣品的基因相對表達量，使用單因素方差分析(One-Way ANOVA)對數據進行分析，結果以平均值±標準誤表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 物種間保守性

將雞let-7a-5p成熟序列與人、小鼠、大鼠、獼猴、牛、原雞、鱈魚和山羊進行比對，發現其與8個物種let-7a-5p的成熟序列完全一致，長度均為22 nt，表現出高度的物種保守性。

2.2 let-7a-5p靶基因預測

利用在線軟件miRDB、TargetScan、miRanda預測得到let-7a-5p的靶基因分別為562、365和283個，三者交集共獲得38個基因集合(圖1)。

圖1 let-7a-5p的靶基因預測結果Fig.1 Predicted results of let-7a-5p target genes

2.3 let-7a-5p靶基因GO功能注釋分析

對38個let-7a-5p靶基因集合注釋分析發現，在生物過程中，靶基因富集較多的前4個GO條目分別是細胞過程(cellular process)、代謝過程(metabolic process)、生物調節(biological regulation)和生物過程調節(regulation of biological process)；在細胞成分中，靶基因在細胞(cell)和細胞部分(cell part)富集最多，其次在細胞器(organelle)和細胞器部分(organelle part)富集較多；在分子功能中，靶基因富集最多的GO條目是結合(binding)，其次在催化活性(catalytic activity)條目也富集較多(圖2)。

圖2 let-7a-5p靶基因的GO功能富集條目Fig.2 GO function enrichment terms of let-7a-5p target genes

2.4 let-7a-5p靶基因KEGG通路富集分析

通過KEGG通路富集分析發現，let-7a-5p的38個靶基因在聚酮糖單元生物合成(polyketide sugar unit biosynthesis)、AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發癥中的作用(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、泛素介導的蛋白水解(ubiquitin mediated proteolysis)、TGF-β信號通路(TGF-beta signaling pathway)和加壓素調節的水重吸收(vasopressin-regulated water reabsorption)顯著富集。前20個通路中富集最多的是代謝途徑(metabolic pathways)、AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發癥中的作用、泛素介導的蛋白水解和MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)(圖3)。

圖3 let-7a-5p靶基因KEGG通路富集分析Fig.3 KEGG pathway enrichment analysis of let-7a-5p target genes

2.5 let-7a-5p靶基因互作分析

miRNA主要作用于mRNA的3′-UTR，通過抑制或降解靶基因發揮調控作用。在miRNA-靶基因調節網絡中，一個miRNA可以靶向調節多個mRNA的表達。本研究中，let-7a-5p通過靶向抑制基因表達，從而在生物過程中扮演重要角色(圖4)。

圖4 let-7a-5p與靶基因調控網絡Fig.4 let-7a-5p and target gene regulatory network

2.6 靜原雞let-7a-5p的組織表達

由圖5可知，let-7a-5p在靜原雞公、母雞的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸肌和腿肌組織中均有表達，且在胸肌和腿肌中表達量均較高，其中，在母雞的心臟和腿肌中高表達，與其他幾個組織間存在顯著差異(P<0.05)；除了在公雞的肝臟中表達量較低外，其他組織中表達量相對較高，且肝臟與肺臟間存在顯著差異(P<0.05)。

①A，母雞；B，公雞。②數據肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05) ①A，Female;B,Male.②Values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05)；While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05)圖5 靜原雞let-7a-5p的組織表達分析Fig.5 Tissue expression analysis of let-7a-5p in Jingyuan chickens

3 討 論

隨著分子生物學的快速發展，miRNA功能在不同物種中的研究日益增多。在豬的肌肉形成和肉質調控方面[18-19]，miR-1、miR-133、miR-206被證實在肌細胞形成過程中發揮了重要調控作用[20]，其中miR-1和miR-133主要在骨骼肌的形成過程中發揮作用，而miR-206主要通過調控組蛋白脫乙酰酶4(HDAC4)的表達來調控成肌細胞的分化過程[21]。在快大型白羽肉雞與杏花雞的研究中發現，生長激素受體(GHR)基因是差異表達基因miR-146b-3p作用的靶點，且miR-34c、miR-223、miR-146b-3p、miR-21和miR-205a在肌肉生長調控中發揮著重要作用[22]。大量研究表明，位于細胞質的一些lncRNAs可與miRNA結合而在動物生長、肌肉發育[23]及脂肪的形成和代謝[24]過程中發揮重要的調控作用。lnc-MD1可與MAML1和MEF2C競爭性結合miR-133和miR-155，從而提高這2個基因的表達水平，在肌肉分化中發揮作用[23]。但目前有關miRNA在靜原雞肌肉生長發育及肉品質上的相關研究甚少。

miRNA的表達具有明顯的種屬、組織特異性及時空特征，明確miRNA在特定發育階段不同組織器官中的表達水平，對研究miRNA在這些組織器官和發育階段的生物學過程中所起的作用具有重要意義。let-7家族是miRNA中研究最深入的小RNA，參與發育時序性調節[25]。研究發現，let-7a在腫瘤細胞的增殖[26-31]、分化[32-33]、脂肪生成及藥物敏感性[34]等方面發揮著重要調控作用，過表達let-7a可以抑制肺癌在裸鼠中的轉移[35]。因此，let-7a在機體多種生物學過程中具有重要的調控功能。本研究使用生物信息學軟件預測let-7a-5p的靶基因，根據miRDB、TargetScan和miRanda的不同算法預測得到靶基因數分別為562、365和283個，為了提高靶向關系的準確性，取3個軟件預測的交集作為下一步分析的基因集合，共有38個靶基因集合在細胞過程、代謝過程和生物調節等生物過程，細胞和細胞部分等細胞成分，以及結合和催化活性等分子功能中。let-7a-5p預測的靶基因顯著富集于聚酮糖單元生物合成、AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發癥中的作用、泛素介導的蛋白水解、TGF-β信號通路和加壓素調節的水重吸收通路中。TGF-β是一類多功能的分泌蛋白，屬于轉化生長因子超家族，包含3種亞型：TGF-β1、TGF-β2以及TGF-β3。在成肌細胞狀態轉換過程中，TGF-β的3種亞型均可以促進成肌細胞的增殖，通過促進MyoD降解和抑制MyoG的表達來抑制成肌細胞的分化[36]。因此，推測let-7a-5p通過TGF-β信號通路作用于靶基因的表達，進而參與調節靜原雞成肌細胞的增殖與分化。

本研究中，let-7a-5p在靜原雞心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸肌和腿肌組織中均有表達，且在公、母雞的胸肌和腿肌中表達量均較高，表明let-7a-5p可能調控靜原雞肌肉的生長發育，但仍有待于進一步研究。

4 結 論

let-7a-5p的成熟序列在多個物種間高度保守，其38個靶基因集合顯著富集于聚酮糖單元生物合成、AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發癥中的作用、泛素介導的蛋白水解、TGF-β信號通路和加壓素調節的水重吸收等信號通路。let-7a-5p下游可能通過調節多個潛在靶基因的表達，進而調控靜原雞成肌細胞的增殖與分化。let-7a-5p在靜原雞胸肌和腿肌中表達量較高，說明其在靜原雞肌肉組織生長發育中扮演著重要角色。