響應面法優化含活性肽CC34畢赤酵母重組菌凍干營養保護劑的研究

李 爽，杜家華，白志輝，曲 可，蘇 苗，姜 寧，張愛忠

(黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江省寒區飼料資源高效利用與營養調控重點實驗室，農業農村部東北平原農業綠色低碳重點實驗室，大慶 163319)

肽是2個或2個以上的氨基酸以肽鍵相連構成的化合物，在動物機體內可以發揮重要的生理功能。具有生物活性的多肽稱為活性肽，又稱生物活性肽，其種類繁多，其中宿主防御肽就是一種可以通過誘導生物體發生免疫反應而產生的小分子多肽[1]?；钚噪牡纳飳W功能十分多樣，具有能抵抗多種細菌、不產生耐藥性等優勢[2]，在機體的生長、發育、免疫調節和新陳代謝中發揮著重要作用。將活性肽轉化到畢赤酵母表達系統中可以提高活性肽在重組菌中的表達量[3]。為了保證菌種的質量，保持菌種的活力，選用正確的菌種保存方法和技術十分重要，而凍干菌粉便于長期儲存和使用，在實踐和研究中取得了理想的效果[4-5]。冷凍干燥技術一直是生產干燥細菌粉末的經典方法，也被證明是保存細菌最方便和成功的方法，然而干燥過程是在低溫下進行的，細菌菌體可能會受到不可逆轉的損害[6]，而且并非所有菌株都能存活或保留功能活性，如生物防治活性、冷凍干燥后的酶活性和酸化活性[7]。在冷凍干燥的低溫環境下，由于細胞內鹽濃度增加，胞內的水分會隨之向胞外滲透，滲透出的水遇冷形成冰晶，這種滲透休克是細胞活力喪失的主要原因[8]。低溫保護劑能將微生物固定在具有高黏度和低流動性反應的材料中，可防止細胞活力喪失。在低溫保護劑成分中，蔗糖、乳糖、海藻糖、葡萄糖、山梨醇、谷氨酸鈉、抗壞血酸和脫脂乳粉是凍干酵母和畢赤酵母屬最常用的保護劑[9]。Abadias等[10]研究表明，添加10%脫脂乳粉對念珠菌CPA-1有較好的凍干保護效果。張菊等[11]用復合保護劑(含脫脂乳粉20%、海藻糖10%、甘油2%和低聚木糖5%)保護植物乳桿菌，可使其凍干存活率達到80%以上。陳合等[12]研究發現，添加0.6%的山梨醇可以使雙歧桿菌凍干存活率達到77%。但凍干保護劑的保護效果因微生物菌株而異，目前鮮見有關基因重組畢赤酵母菌凍干保護劑的研究。本實驗室前期獲得了含活性肽CC34的畢赤酵母菌重組菌[13]，為了能使其更好地應用到生產實踐中，本研究擬通過單因素篩選結合響應面分析法優化凍干畢赤酵母重組菌保護劑配方，使其具備高穩定性和高活力，以期為含活性肽CC34畢赤酵母重組菌商業化生產提供保障。

1 材料與方法

1.1 材料

含活性肽CC34畢赤酵母重組菌：將活性肽CC34利用電轉方法轉入畢赤酵母菌SMD1168中，由黑龍江八一農墾大學動物營養實驗室提供；脫脂乳粉、海藻糖、山梨醇、谷氨酸鈉均購自北京博奧拓科技有限公司；YPD基礎培養基：蛋白胨2%，酵母浸出粉1%，葡萄糖2%；YPD固體培養基：在液體培養基基礎上加入2%的瓊脂粉即可，YPD液體及固體培養基115 ℃滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 畢赤酵母重組菌活化 將置于-80 ℃的甘油保菌管取出，解凍。用接種環沾取菌液后在YPD固體培養基上平板劃線，于30 ℃恒溫培養箱中培養16～18 h。用接種環挑取單菌落接種到YPD液體培養基中，在30 ℃條件下220 r/min搖床培養。

1.2.2 畢赤酵母重組菌的凍干及復水 畢赤酵母重組菌30 ℃條件下220 r/min搖床培養18 h，4 ℃、4 000 r/min離心20 min，棄掉上清液收集菌泥。按照菌泥∶保護劑=1∶2比例加入凍干保護劑，取1 mL分裝至西林瓶后用膠塞密封處理，于-20 ℃預凍3 h后放入真空冷凍干燥機(冷凍溫度為-56 ℃、真空度為1 Pa)凍干24 h。凍干成粉后加入YPD液體培養基至凍干前體積。

1.2.3 單一保護劑的篩選 將4種單一保護劑加入無菌水配制到所需濃度(W/V)，具體為：脫脂乳粉濃度1%、5%、10%、15%、20%，海藻糖濃度5%、10%、15%、20%、25%，山梨醇濃度5%、10%、15%、20%、25%，谷氨酸鈉濃度1%、2%、3%、4%、5%，于115 ℃滅菌15 min。按照1.2.2的方法制備凍干菌粉，通過活菌計數法考察單一保護劑在不同濃度下的保護效果。根據單因素試驗保護效果排序，選擇效果較好的前3種凍干保護劑為最優單因素進行下一步的復配試驗。

1.2.4 響應面法優化畢赤酵母重組菌凍干保護劑配比 根據單因素試驗結果，從4種單一保護劑中選擇保護效果較好的3種：脫脂乳粉、海藻糖和山梨醇，分別設定為變量A、B、C，畢赤酵母重組菌的凍干存活率為響應值(Y)，采用Design-Expert 12軟件設計17組試驗，12組為析因點試驗，5組為重復零點試驗，因素水平見表1。

表1 試驗各因素水平表Table 1 Test factors and levels %

1.3 測定指標

活菌計數采用YPD液體培養基復水至原體積；菌種計數采用梯度稀釋平板法；菌體存活率計算公式為：

酵母存活率(%)=(冷凍干燥后每毫升菌液活菌數/冷凍干燥前每毫升菌液活菌數)×100%

1.4 數據分析

采用Design-Expert 12.0軟件進行響應面的設計、數據的分析和回歸模型的建立；采用SPSS 23.0軟件對單因素試驗數據采用One-Way ANOVA、Tukey’s 檢驗進行方差分析和多重比較，每組試驗重復3次，每次2個平行樣，試驗結果以平均值±標準差表示。P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 脫脂乳粉對畢赤酵母重組菌凍干存活率的影響 由圖1A可知，與空白組相比，添加不同濃度的脫脂乳粉對畢赤酵母重組菌凍干存活率均有顯著提高(P<0.05)。在0～10%范圍內，菌體凍干存活率隨脫脂乳粉濃度的增加而提高，當脫脂乳粉濃度達到10%時凍干存活率最大，為51.23%。但當脫脂乳粉濃度超過10%時，凍干存活率隨脫脂乳粉濃度的增加反而下降。

2.1.2 海藻糖對畢赤酵母重組菌凍干存活率的影響 由圖1B可知，與空白對照組相比，添加海藻糖對提高畢赤酵母重組菌凍干存活率均起到了顯著的效果(P<0.05)，海藻糖濃度為10%、15%、20%時保護效果較好。當海藻糖濃度增加到15%時凍干存活率最大，為67.50%，但當海藻糖濃度超過15%時，畢赤酵母重組菌的存活率呈現逐步下降趨勢。

2.1.3 山梨醇對畢赤酵母重組菌凍干存活率的影響 由圖1C可知，山梨醇濃度在0～20%的范圍內，隨著山梨醇濃度的增加，畢赤酵母重組菌凍干存活率逐漸提高，當山梨醇濃度為20%時，畢赤酵母重組菌凍干存活率最高，為52.19%，顯著高于其他濃度條件下的凍干存活率(P<0.05)。

2.1.4 谷氨酸鈉對畢赤酵母重組菌凍干存活率的影響 由圖1D可知,當谷氨酸鈉添加量為1%時，凍干保護效果與空白組沒有顯著差異(P>0.05)；當添加量為3%時，畢赤酵母重組菌凍干存活率最大，為36.92%，顯著高于其他各組(P<0.05)。

添加以上4種凍干保護劑均起到了較好的保護效果，保護劑保護效果排序為海藻糖>山梨醇>脫脂乳粉>谷氨酸鈉。選擇前3種凍干保護劑為最優單因素，進行下一步的復配方案。

2.2 Box-Behnken響應面優化復合凍干保護劑配比

以3種保護劑進行響應面設計，共17組，12組為析因點試驗，5組為重復零點試驗，分別測定畢赤酵母重組菌凍干存活率，結果見表2。采用Design Expert 12.0軟件對表2數據進行二次回歸方程擬合，得到菌體存活率(Y)對脫脂乳粉(A)、海藻糖(B)、山梨醇(C)的二次多項回歸方程：Y=76.20+6.57A+4.18B+0.60C-1.83AB-1.19AC+2.94BC-20.94A2-14.23B2-11.37C2。

①A、B、C和D分別為脫脂乳粉、海藻糖、山梨醇和谷氨酸鈉的效應。②肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05) ①A,B,C and D indicated the effects of skim milk powder,trehalose,sorbitol and sodium glutamate,respectively. ②Values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05);While with the same letter superscripts mean no significant differences圖1 不同凍干保護劑對畢赤酵母重組菌存活率的影響Fig.1 Effects of different freeze-drying protectants on the survival rate of recombinant Pichia pastoris

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface experiment

續表

表3 響應面試驗方差分析表Table 3 Variance analysis of regression model

通過軟件Design-Expert 12.0繪制脫脂乳粉、海藻糖、山梨醇對畢赤酵母重組菌體存活率的交互作用和響應面分析圖(圖2)。由圖2可知，3個響應面均具有極值點，都為開口向下的凸形球面。根據響應面建立的數學模型分析，最佳的凍干保護劑配方為：脫脂乳粉濃度為10.75%、海藻糖濃度為15.70%、山梨醇濃度為20.19%，在此條件下預測菌體存活率為77.00%。

圖2 脫脂乳粉、海藻糖以及山梨醇交互作用等高線圖及相應響應面圖Fig.2 Contour maps and corresponding response surface maps of interaction of skim milk powder,trehalose and sorbitol

2.3 驗證試驗結果

將畢赤酵母重組菌按篩選出的最優配比進行3組重復試驗，畢赤酵母重組菌平均存活率為(78.98±1.63)%。

3 討 論

徐穎等[14]研究發現，隨著脫脂乳粉濃度的增加，脫脂乳粉對富硒鼠李糖乳桿菌的保護效果也隨之提高，達到飽和后，隨著脫脂乳粉濃度的提高，菌體的存活率趨于穩定或些許下降。脫脂乳粉是一種常見的大分子胞外保護劑[15]，在凍干過程中脫脂乳粉可以在菌體表面自然形成保護層以防止菌體受到損害，而且脫脂乳粉當中還含有大量的蛋白和糖類對細胞起到固定作用，蛋白和糖類能減少細胞與介質的接觸面積，增強細胞壁免遭損傷，避免細胞內的物質滲漏[16]。在本試驗中，當脫脂乳粉濃度達到10%時凍干菌存活率最高，之后隨濃度繼續增加其保護效果反而降低，結合實際生產成本方面的考慮，脫脂乳粉濃度選擇10%比較適宜。

海藻糖作為一種雙糖，在菌體失水的情況下，海藻糖能夠與菌體失水點通過氫鍵相連形成新的保護層，降低冰晶的形成損壞細胞膜，充分起到保護細胞膜結構的作用[17]。在蛋白質冷凍的過程中能填充到因蛋白質失水而形成的空缺中，從而有效地抑制微生物中的蛋白質在冷凍過程中發生的變性[18]。張瑤等[19]發現，當海藻糖作為單一保護劑且濃度為12%時，對植物乳桿菌V02保護效果最好。從本試驗結果看，當海藻糖在15%時，對畢赤酵母重組菌起到了較好的保護效果。

對于不同的菌種，保護劑的保護能力不盡相同。山梨醇具有良好的保濕性能，可以與水分子結合，同時能夠極易滲透進微生物的細胞內部[20]，進入細胞內的山梨醇使其內部的黏性更強，黏稠度高可抑制水形成冰晶，進而保護細胞不受損壞，還可以維持細胞的活性[21]。本試驗結果表明，20%的山梨醇對畢赤酵母重組菌起到了顯著的保護作用。

本試驗通過單因素篩選試驗初步確定了所選取的凍干保護劑的濃度范圍，然后結合響應面分析得出3種保護劑(脫脂乳粉、海藻糖和山梨醇)的最優濃度。三者的相互結合使得菌體的存活率得到更穩固的保障。響應面曲面圖直觀反映各因素間的交互作用對響應值影響的顯著程度，曲面圖越陡表示交互作用越強，曲面圖越平則表示交互作用越弱。本試驗對響應面模型預測結果進行了驗證，使用10.75%的脫脂乳粉、15.70%的海藻糖和20.19%的山梨醇作為活性肽CC34畢赤酵母重組菌的凍干保護劑，菌體存活率為78.98%，與響應面法的預測值77.00%接近，說明利用響應面法建立的數學模型可信度較高。

許多研究表明，單獨使用一種保護劑通常不能很好地保護菌株在冷凍干燥過程中的穩定性。不同的冷凍參數也會對相同菌株產生不同的應力反應。因此，在選擇保護劑時要考慮能否保持菌株穩定、保護劑能否起到保護作用、配方成本最低等。在實際應用中，可以選擇多種保護劑以復配的方式來提高菌體凍干存活率。如糖類保護劑與蛋白質易產生氫鍵，但緩沖能力比較弱，這時可以用氨基酸類保護劑進行彌補[22]。因此，在冷凍干燥過程中選擇最優配方和最佳凍干工藝，不僅能最大限度地提高菌株穩定性，還能控制保護劑成本。

4 結 論

畢赤酵母重組菌復合凍干保護劑配方為：脫脂乳粉濃度為10.75%，海藻糖濃度為15.70%，山梨醇濃度為20.19%。采用響應面法預測出的菌體凍干存活率為77.00%，通過驗證試驗獲得的菌體凍干存活率達到78.98%。該復合凍干保護劑可用于對畢赤酵母重組菌的保存和后續試驗的研究。