巨胞飲途徑介導的新冠原始株病毒蛋白入胞的細胞水平初步研究

江 淦，楊于權，陳曜星，侯照遠，高小玲，陳紅專，3#，賈 浩#

1.上海交通大學基礎醫學院藥理學與化學生物學系，上海高校轉化醫學協同創新中心，上海 200025；2.上海交通大學基礎醫學院生物化學與分子細胞生物學系，上海市腫瘤微環境與炎癥重點實驗室，上海 200025；3.上海中醫藥大學交叉科學研究院，上海 201203

嚴重急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndromes，SARS）冠狀病毒和中東呼吸綜合征冠狀病毒均可誘導持續的巨胞飲作用，而抑制該作用可降低相關的病毒滴度［1］。值得注意的是，細胞因子、趨化因子和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）均可誘導炎癥細胞的巨胞飲作用，提示合并感染或者炎癥因子風暴會進一步加強細胞的巨胞飲作用［2-3］。此前已有預測發現，嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）的蛋白與人細胞蛋白之間存在蛋白-蛋白相互作用，且與細胞骨架和許多其他功能蛋白密切相關［2，4］。因此，探索SARS-COV-2 原始株蛋白對促進細胞尤其是炎癥相關細胞的巨胞飲作用具有重要的價值和意義。

巨胞飲是一種高度保守的內吞途徑，蛋白質、生長因子、細胞因子、病毒等胞外物質通過刺激細胞膜形成褶皺，進而形成可被內化的巨胞飲囊泡。在細胞中，巨胞飲受多種與肌動蛋白、微絲重構、皺褶形成、囊泡形成等相關的基因的調控。正常狀態下，巨胞飲作用與細胞生長、抗原提呈、凋亡細胞清除等有關［5-7］。而在病理狀態（如腫瘤、炎癥等）下，巨胞飲作用將會被上調［8-9］，尤其是在囊膜病毒（如冠狀病毒、流感病毒、HIV病毒、埃博拉病毒等）中。這些病毒可利用巨胞飲途徑進入細胞，在病毒感染后4 h即可啟動復制，而在病毒衣殼蛋白、核苷酸物質完全進入細胞后更加顯著，并在病毒復制、細胞間傳播中起到重要作用，該過程與囊膜表面的糖蛋白、病毒表面蛋白促進宿主細胞的巨胞飲作用均有關聯［10-13］。因此，SARS-COV-2原始株表面及其入侵相關的病毒蛋白是否能夠促進細胞的巨胞飲作用需要進一步的探索。

基于此，本研究通過免疫共沉淀技術、高內涵篩選、共聚焦顯微成像、流式細胞術等分析原始株SARS-CoV-2 的表面蛋白——刺突蛋白受體結合域（spike protein receptor-binding domain，S-RBD）、核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，N）和SARS-CoV-2的入侵相關蛋白——非結構蛋白7（non-structural protein-7，NSP7）等病毒蛋白與細胞內蛋白的相互作用，及與多種細胞模型的巨胞飲水平的關系。同時，在本課題組的前期研究［14-15］中，我們已建立了可遞送干擾小RNA（small interfering RNA，siRNA）的脂蛋白納米藥物載體平臺，該系統可通過巨胞飲作用被靶細胞內化。因此，本研究再利用5-（N-乙基-N-異丙基）阿米洛利（EIPA，一種巨胞飲的內吞作用抑制劑）、載帶Rab5siRNA 的磷酸鈣-重組高密度脂蛋白（CaP-rHDL）納米藥物載體共2 種方式干擾巨胞飲水平，以分析細胞對病毒蛋白的攝取情況，從而為可能的抑制巨胞飲作用的潛在先導藥物研究提供篩選通路。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞及質粒 人胚腎細胞HEK-293T、小鼠腦微血管內皮細胞bEnd.3 均購自美國菌種保藏中心，人支氣管上皮細胞Beas-2b 由上海交通大學基礎醫學院沈瑛課題組惠贈。表達質粒His-SARS-CoV-2 SRBD、His-SARS-CoV-2 N 和His-SARS-CoV-2 NSP7均由上海交通大學系統生物醫學研究院陶生策教授惠贈。

1.1.2 主要試劑 His（sc-8036）抗體、Rab5（sc-46692）抗體均購自美國Santa Cruz 公司，快速銀染試劑盒（P0017S）購自上海碧云天生物技術有限公司，1，2-油?；字幔―OPA）、1，2-二肉豆蔻酰-SN-甘油-3-磷酰膽堿（DMPC）均購自美國Avanti Polar Lipids 公司，重組人載脂蛋白E3（apoliprotein E3，ApoE3）購自美國派普泰克公司，質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒均購自美國Axygene公司，RNA提取試劑、BCA 蛋白定量試劑盒和探針法熒光定量PCR 試劑盒（qPCR Mix）均購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 納米藥物載體的制備 采用反相微乳法制備載有Rab5siRNA 的磷酸鈣藥物核心，并進一步與4 mg DMPC 混合。37 ℃下，將該混合物于旋蒸儀（德國，Büchi）上（100 r/min）旋蒸1 h 以去除氯仿，并形成含磷酸鈣藥物的磷脂薄膜。將獲得的脂質膜用4 mL 雙蒸水進行水化，并行短暫的超聲處理。而后，將上述脂質體與ApoE3于37 ℃下孵育36 h（ApoE3與DMPC的質量比為1∶8），以獲得載帶Rab5siRNA 的磷酸鈣-重組高密度脂蛋白（CaP-rHDL）納米藥物載體。

1.2.2 重組蛋白的表達與純化 將表達質粒His-SARS-CoV-2 S-RBD、His-SARS-CoV-2 N 原 始 株 和His-SARS-CoV-2 NSP7 分別轉入大腸埃希菌E.coliBL21 感受態細胞中，經倒置培養后將獲得的陽性克隆接種于5 mL LB 液體培養基（含100 μg/mL 羧芐青霉素），并于37 ℃、180 r/min 下震蕩3 h。當細菌培養液D（600 nm）達到0.6～0.8 時，分別向其中加入0.2 μmmol/L IPTG，并于150 r/min搖床上16 ℃過夜。經離心后，將細菌沉淀重懸于裂解緩沖液［含50 μmol/L Tris-HCl （pH 8.0）、500 μmol/L NaCl 和20 μmol/L咪唑（pH 8.0）］中。將裂解后的上述3種菌體上清液分別經鎳柱瓊脂糖珠純化后，再用裂解緩沖液進行洗滌，最后用1 mL 緩沖液［含50 μmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、500 μmol/L NaCl 和300 μmol/L咪唑（pH 8.0）］洗脫后凍存。

1.2.3 質譜法鑒定SARS-CoV-2 原始株的S-RBD、N、NSP7病毒蛋白的互作蛋白 將SARS-CoV-2原始株的S-RBD、N、NSP7病毒蛋白分別與HEK-293T細胞 共 孵 育 后 ， 采 用 免 疫 共 沉 淀 （coimmunoprecipitation） 和蛋白質印跡法（Western blotting）分析與病毒蛋白相互作用的胞內蛋白；其中，前者分別使用His抗體和Rab5抗體進行富集，后者采用8%的分離膠進行蛋白純化，具體步驟見前期研究［16］。隨后，用質譜法（Mass Spectrometry，MS）檢測與原始株病毒蛋白發生相互作用的蛋白。本實驗所用蛋白組學檢測及分析均委托上海交通大學醫學院基礎醫學公共技術平臺——蛋白組學平臺完成。

1.2.4 SARS-CoV-2 原始株的病毒蛋白的細胞攝取和巨胞飲水平分析

（1）高內涵篩選：分別將HEK-293T、bEnd.3 和Beas-2b 細胞（正常細胞模型）接種至96 孔板中，并于37 ℃、5%CO2條件下培養過夜。將上述3 種細胞分別與SARS-CoV-2 原始株的病毒蛋白（S-RBD、N和Nsp7）或DMEM 培養基在37 ℃下孵育1.5 h 或8.5 h， 再分別向其中添加異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記的70 kDa 葡聚糖（FITC-70 kDa-葡聚糖，即巨胞飲特異性標志物）后共培養1.5 h。將上述細胞進行洗滌、4%甲醛固定后，于高內涵篩選進行分析。

（2）共聚焦顯微成像及流式細胞儀分析：將HEK-293T細胞（正常細胞模型）分別接種至96孔板或12 孔板中，于37 ℃、5%CO2條件下培養過夜。取1 μg/mL LPS 與HEK-293T 細 胞 共 孵 育24 h，獲 得LPS誘導的炎癥細胞模型。將上述正常細胞、炎癥細胞分別與75 μmol/L EIPA 或DMEM 培養基預孵育0.5 h，再分別與SARS-CoV-2 原始株的病毒蛋白（SRBD、N 和Nsp7）于37 ℃下孵育1.5 h，而后分別向其中添加FITC-70 kDa-葡聚糖，共培養1.5 h。經固定后，將上述細胞分別與His 抗體共孵育過夜，再行熒光二抗孵育，于共聚焦顯微鏡下觀察細胞的熒光水平，再利用Image J軟件對共聚焦圖像中的熒光強度進行分析；或通過流式細胞儀檢測上述細胞的熒光水平，以反映細胞的巨胞飲水平及病毒蛋白入胞的變化。

1.2.5 經納米藥物載體處理后細胞的巨胞飲水平分析 將載帶Rab5siRNA 的磷酸鈣-重組高密度脂蛋白（CaP-rHDL）納米藥物載體與HEK-293T 細胞孵育12 h 后，采用實時熒光定量PCR（quantitative realtime PCR，qPCR）和Western blotting 分析Rab5的表達，以驗證其敲低水平。而后，以Rab5被抑制的HEK-293T細胞為對象，將其分別與3個SARS-CoV-2原始株的病毒蛋白于37 ℃下孵育1.5 h，添加FITC-70 kDa-葡聚糖后共培養1.5 h，于流式細胞儀檢測上述細胞的熒光水平變化。Rab5siRNA 由上海吉瑪制藥技術有限公司合成，序列如表1。

表1 Rab5 siRNA序列Tab 1 Sequences of Rab5 siRNA

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0 軟件對數據進行統計分析。采用皮爾森相關系數對細胞的共聚焦圖像進行分析，表征His 標簽的病毒蛋白與巨胞飲囊泡（FITC-70 kDa-葡聚糖）的共定位水平。采用單因素方差分析（oneway ANOVA）、雙因素方差分析（two-way ANOVA）對細胞熒光水平進行比較，并采用Bonferroni 進行檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 SARS-CoV-2原始株的S-RBD、N和NSP-7入胞后與Rab家族蛋白結合

本研究用表達質粒His-SARS-CoV-2 S-RBD、His-SARS-CoV-2 N 和His-SARS-CoV-2 NSP7原始株模擬病毒蛋白感染的過程，分析病毒蛋白在HEK-293T原始株細胞中的表達。Western blotting檢測結果（圖1）顯示，經純化和表達的His-S-RBD、His-N和His-NSP7蛋白具有良好的特異性，與之前的報道［17］相一致。

圖1 Western blotting 檢測His-S-RBD、His-N 和His-NSP7 蛋白的純化表達Fig 1 Detection of purified expressions of His-S-RBD, His-N and His-NSP7 proteins by Western blotting

隨后，在HEK-293T 細胞中利用免疫共沉淀技術分析與S-RBD、N 和NSP7 病毒蛋白的互作蛋白，經純化、分離、銀染后我們發現互作蛋白存在不同的條帶（圖2A）；繼而表明，SARS-CoV-2 原始株的3 個病毒蛋白可與細胞內多種蛋白發生相互作用。通過MS 對上述條帶進行分析，我們鑒定得到了大量的互作蛋白，其中Rab小GTPase超家族分別與3個病毒蛋白的結合數量均較多，即與S-RBD 蛋白結合了101 個、與N 蛋白結合了97 個、與NSP7 蛋白結合了111個（圖2B）。進一步我們發現，在與NSP7結合的Rab 小GTPase 超家族中，Rab5 的表達量最高（圖2C），且先前研究［18］提示Rab5 參與了巨胞飲的調控過程，故本研究提示病毒蛋白入胞后可能參與調控巨胞飲通路。此觀點有待進一步驗證。

隨后，免疫共沉淀實驗中我們利用His 抗體進行富集，再采用Western blotting 對富集結果進行檢測，結果（圖2D）顯示SARS-CoV-2 原始株的病毒蛋白（S-RBD、N 和NSP7）在HEK-293T 細胞中均可與內源性Rab5 蛋白相互作用；且與S-RBD、N 蛋白相比，SARS-CoV-2原始株的NSP7蛋白與Rab5的結合更強。與此同時，我們利用Rab5 抗體進行富集后再行Western blotting 檢測，結果（圖2E）顯示，內源性Rab5 蛋白也能與SARS-CoV-2 原始株蛋白（S-RBD、N和NSP7）相結合。

圖2 SARS-COV-2原始株的S-RBD、N和NSP7蛋白與Rab5小GTPase家族蛋白的相互作用Fig 2 Interaction between S-RBD,N and NSP7 proteins of SARS-COV-2 and Rab5 small GTPase family proteins

2.2 SARS-CoV-2原始株的S-RBD、N和NSP-7蛋白可以增強HEK-293T/bEnd.3/Beas-2b 細胞的巨胞飲水平

于體外檢測SARS-CoV-2 原始株的關鍵蛋白（SRBD、N 和NSP7）能否刺激3 種正常細胞模型產生巨胞飲作用。本研究利用高內涵篩選分析細胞模型內化FITC-70 kDa-葡聚糖后的熒光水平。在HEK-293T細胞模型中，共聚焦顯微成像顯示，分別與S-RBD、N 和NSP7 病毒蛋白孵育3 h 后的細胞內化FITC-70 kDa-葡聚糖的能力均高于DMEM 組（均P＜0.05，圖3A、3B）；且S-RBD、N 和NSP7 病毒蛋白被攝取入胞后，均可與FITC-70 kDa-葡聚糖共定位（圖3C、3D）。流式細胞術的結果（圖3E）同樣顯示，在分別與3 個病毒蛋白孵育3 h 后，細胞的巨胞飲作用均有所增強。綜合上述結果我們發現，SARS-COV-2 原始株的S-RBD、N 和NSP7 病毒蛋白可刺激HEK-293T細胞的巨胞飲作用。

圖3 SARS-COV-2原始株的S-RBD、N和NSP7蛋白刺激HEK-293T細胞的巨胞飲作用Fig 3 S-RBD,N and NSP7 proteins of SARS-COV-2 stimulated the macropinocytosis in HEK-293T cells

同時，在bEnd.3細胞模型、Beas-2b細胞模型中，共聚焦顯微鏡結果（圖4A～4D） 顯示，分別與SARS-COV-2 原始株的S-RBD、N 和NSP7 病毒蛋白孵育后，上述2 種細胞的胞內FITC-70 kDa-葡聚糖水平也有顯著上調。流式細胞術分析結果（圖4E、4F）亦顯示，分別與3個病毒蛋白孵育3 h后，該2種細胞的巨胞飲水平均有所增強。

圖4 SARS-COV-2原始株的S-RBD、N和NSP7蛋白刺激bEnd.3和Beas-2b細胞的巨胞飲作用Fig 4 S-RBD,N and NSP7 proteins of SARS-COV-2 stimulated the macropinocytosis in bEnd.3 and Beas-2b cells

2.3 SARS-CoV-2原始株的S-RBD、N和NSP-7蛋白可以增強LPS誘導的炎癥細胞的巨胞飲水平

本研究進一步分析相關病毒蛋白對炎癥細胞的巨胞飲作用。共聚焦顯微成像結果（圖5A、5B）顯示，分別與原始株S-RBD、N 和NSP7 病毒蛋白孵育后，LPS 誘導的HEK-293T 細胞的巨胞飲作用均有明顯上升；且S-RBD、NSP7 病毒蛋白與FITC-70 kDa-葡聚糖有明顯的共定位，而N 病毒蛋白共定位的系數較低。流式細胞術分析的結果（圖5C）顯示，LPS 誘導的HEK-293T 細胞在分別與S-RBD 原始株、N 和NSP7 病毒蛋白孵育后，其攝取的FITC-70 kDa-葡聚糖的水平較未經LPS 誘導的HEK-293T 細胞有顯著升高。這些結果均提示，SARS-CoV-2 原始株的病毒蛋白可誘導多種細胞特別是炎癥細胞的巨胞飲作用，且在合并炎癥的情況下可能會進一步加強細胞對病毒蛋白的攝取能力。

圖5 SARS-CoV-2原始株的S-RBD、N和NSP-7蛋白刺激LPS誘導的炎癥細胞的巨胞飲作用Fig 5 S-RBD,N and NSP7 proteins of SARS-COV-2 stimulated the macropinocytosis in LPS-induced inflammatory cells

2.4 EIPA 可以抑制由SARS-CoV-2 原始株的SRBD、N 和NSP-7 蛋白刺激的正常及炎癥細胞的巨胞飲水平

采用共聚焦顯微成像和流式細胞術就巨胞飲抑制劑——EIPA 對病毒蛋白刺激的巨胞飲水平的抑制作用及對His 標記的病毒蛋白進入細胞模型的抑制作用進行分析。在EIPA 的預處理下，無論是正常細胞還是LPS 誘導的炎癥細胞，由S-RBD、N 和NSP7 原始株病毒蛋白刺激的巨胞飲水平都受到了顯著抑制（圖6A、6B）。這一結果表明，EIPA 可以通過抑制細胞巨胞飲水平來抑制病毒蛋白的入胞。

圖6 EIPA抑制正常細胞、LPS誘導的炎癥細胞的巨胞飲水平，以及His標記的SARS-CoV-2原始株病毒蛋白的攝入Fig 6 EIPA could inhibit the macropinocytosis level in normal cells and LPS-induced inflammatory cells, and the uptake of His-labeled SARS-CoV-2 proteins

2.5 Rab5 siRNA 納米載體可以抑制由SARS-CoV-2原始株的S-RBD、N 和NSP-7蛋白刺激的巨胞飲水平

將載帶Rab5siRNA的納米藥物載體與HEK-293T細胞共孵育后，分別采用qPCR 和Western blotting 進行檢測，結果（圖7A、7B）發現細胞中的Rab5的mRNA及蛋白表達均被有效抑制。隨后，利用流式細胞儀檢測被抑制Rab5表達的細胞分別與3 個病毒蛋白孵育后的巨胞飲水平變化，結果（圖7C）顯示，在100 nmol/L siRab5-1濃度孵育12 h后，Rab5siRNA納米藥物載體可有效抑制由該3 個病毒蛋白引起的細胞巨胞飲作用。因此，綜合上述結果我們推測，Rab5可能是抑制由SARS-CoV-2原始株的病毒蛋白誘導細胞巨胞飲上調的潛在靶點。

圖7 Rab5 siRNA納米藥物載體抑制由SARS-COV-2原始株的病毒蛋白上調的細胞巨胞飲作用Fig 7 Lipoprotein nano-drug carriers loaded with Rab5 siRNA could inhibit the macropinocytosis level up-regulated by SARS-COV-2 viral proteins

3 討論

本研究表明，SARS-CoV-2原始株相關病毒蛋白可上調多種正常細胞和LPS誘導的炎癥細胞中的巨胞飲水平，在有囊膜病毒入胞后，病毒蛋白與細胞內的正常蛋白可相互作用。同時，我們還發現利用巨胞飲抑制劑——EIPA和之前建立的Rab5siRNA脂蛋白納米藥物載體均可有效減少相關病毒蛋白上調的巨胞飲過程。

巨胞飲途徑在多種細胞的病理生理過程中發揮著重要作用，并受到多種胞外物質的調控［19］。目前，SARS-CoV-2原始株已被證明能夠通過巨胞飲作用的方式形成病毒復制復合物以修飾細胞質膜［1，20］。且相關研究［21］顯示，包括SARS-CoV-2在內的多種病毒均可利用巨胞飲途徑進入細胞，這種入侵方式可適應其顆粒的大小并實現免疫逃逸。我們推測，SARS-CoV-2原始株可能存在同樣的細胞侵入方式。但由于實驗條件的限制，本研究只能探索SARS-CoV-2 原始株的關鍵幾種病毒蛋白與模型細胞孵育后的相互作用，結果顯示在有囊膜病毒入胞后確實存在蛋白質-蛋白質的相互作用。有研究［4］已發現Rab家族可能參與了這種相互作用，將SARS-CoV-2 原始株病毒攜帶至細胞器；繼而提示，該家族可能是一種關鍵的下游蛋白，能夠進一步刺激細胞產生巨胞飲。

除此之外，新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）重癥患者的細胞因子風暴程度遠高于輕癥患者，且細胞因子風暴與疾病的嚴重程度密切相關［22］。與正常細胞相比，炎癥細胞具有更高水平的巨胞飲作用，小G蛋白超家族小分子鳥苷三磷酸酶在LPS誘導的炎癥細胞模型中更為豐富和活躍。因此，SARS-CoV-2 原始株的病毒蛋白是否會導致炎癥細胞內的巨胞飲水平顯著上升，使得在感染后期病毒進入細胞的數量增加，導致進一步的感染從而形成惡性循環，值得我們繼續探索。

在腫瘤細胞中，該類細胞可利用顯著增加的巨胞飲途徑大量攝取入胞的藥物制劑，使得正常細胞與腫瘤細胞間存在攝取差異，從而實現靶向腫瘤的給藥。而在炎癥細胞中，同樣存在被上調的巨胞飲機制，因此同樣可以利用炎癥細胞主動攝取通過巨胞飲途徑入胞的藥物制劑，提高對炎癥細胞的主動靶向給藥效率。由于SARSCoV-2原始株的病毒蛋白確實可以刺激炎癥細胞更高水平的巨胞飲囊泡形成，因此，我們采用定制的脂蛋白納米藥物載體作為工具，利用其巨胞飲這一主要攝取途徑，將siRab5輸送到這些模型細胞中，抑制Rab5的水平從而抑制蛋白-蛋白的相互作用。此外，EIPA是一種臨床批準的利尿劑，同樣也可以抑制細胞的巨胞飲水平，從而抑制病毒的入胞，然而該藥物在肺部和靶細胞的富集尚不如納米藥物載體的靶向富集效果。由于條件受限，本研究尚無法進一步完成假病毒實驗和體內試驗的驗證，且近期有報道提示EIPA僅在較高濃度時（80 μmol/L）可對Spike的假病毒模型入侵293T細胞有抑制效果，但在體內、合并炎癥感染或重癥炎癥因子風暴產生時是否有更明顯的差異，還需進一步的探索?？傊?，本研究提示了巨胞飲機制在SARS-CoV-2原始株感染中的作用以及抑制該機制的潛在靶點，或將為有針對性的先導藥物篩選提供參考。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。All authors disclose no relevant conflict of interests.

作者貢獻/Authors'Contributions

江淦、賈浩參與了實驗設計、實驗驗證和論文寫作；楊于權、陳曜星協助完成實驗驗證；侯照遠、高小玲、陳紅專、賈浩和江淦參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The study was designed and verified by JIANG Gan and JIA Hao.The manuscript was written by JIANG Gan and JIA Hao. The experiments were carried out by YANG Yuquan and CHEN Yaoxing. The manuscript was drafted and revised by HOU Zhaoyuan，GAO Xiaoling，CHEN Hongzhuan，JIA Hao and JIANG Gan. All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-03-16

檢測工作貫穿于瀝青混凝土路面施工的全過程，碾壓成型后的路面必須滿足設計及規范的要求。檢測內容包括：平整度、厚度、寬度、高程等。鉆芯取樣的試件送到試驗室后，要做馬歇爾試驗及其他試驗，根據試驗結果，準確評價瀝青混凝土路面的物理力學性能。檢測項目主要包括：壓實度、空隙率、容重、穩定度、流值等。

·Accepted：2022-05-18

·Published online：2022-06-29

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