Prrx1+牙周膜干細胞在牙移動過程中的譜系示蹤

汪席均，金安婷，黃湘如，徐弘遠，高 昕，楊屹羚，代慶剛，江凌勇

1.上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院口腔顱頜面外科，上海交通大學口腔醫學院，國家口腔醫學中心，國家口腔疾病臨床醫學研究中心，上海市口腔醫學重點實驗室，上海 200011；2.上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院口腔第二門診部，國家口腔醫學中心，國家口腔疾病臨床醫學研究中心，上海市口腔醫學重點實驗室，上海 200011

正 畸 牙 移 動 （orthodontic tooth movement，OTM）的生理學基礎是正畸應力作用下的牙周改建，包括壓力區牙周膜的壓縮及舊牙槽骨基質的吸收、張力區牙周膜的拉伸及新骨基質的形成［1］。牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）是存在于牙周膜中重要的成體牙源性干細胞，具有間充質干細胞的生物學特性［2］，其能夠響應正畸應力，并在該應力刺激下的牙周改建中發揮關鍵作用［3］。長久以來，在OTM 領域中，應力調控PDLSCs 重塑牙周組織的機制研究是諸多學者關注的熱點。既往，國內外學者多采用傳統方法如體外細胞加力、體內簡單動物模型構建等開展研究，但由于體內外環境的差異、體內微環境的復雜性、生長發育的影響等，PDLSCs 在應力刺激下的真實轉歸與其重塑牙周組織的機制難以被深入解析。

細胞譜系示蹤技術是一項利用各種方式對細胞進行標記，并對包括該細胞的后代所有細胞的增殖、分化及遷移等活動進行追蹤觀察的技術。目前譜系示蹤技術包括以下幾種：直接顯微鏡觀察法示蹤技術、細胞移植示蹤技術、Y 染色體示蹤標記、染料和放射性示蹤劑標記、基因轉染技術、MRI 磁性標記成像技術、基因打靶和轉基因技術等［4-5］。近年來，基因打靶和轉基因技術被廣泛應用于對外源標志物基因導入靶細胞的示蹤，其克服了傳統物理標記中的細胞損傷及標記稀釋等問題，但需利用基因組中的位點特異性重組酶序列［6］。目前在位點特異性重組酶系統中，Cre/loxP 和FLP/FRT 重組酶系統使用最為廣泛；其中，Cre/loxP 重組酶系統效率更高，且根據時間是否可控分為一般型和誘導型。與一般型相比，誘導型Cre/loxP 重組酶系統可在特定時間點誘導激活重組酶，實現對該時間點被標記細胞的增殖、分化及遷移活動的觀察。當前，已有眾多學者利用細胞譜系示蹤技術研究體內某一特定分子的作用，如利用Gli1-CreERT2小鼠的研究發現神經膠質瘤相關癌基因同源物1 （glioma-associated oncogene homolog 1，Gli1） 可標記骨形成和骨折修復的成骨祖細胞［7］，通過Gli1-CreERT2小鼠的研究發現圍繞牙槽骨脈管系統的Gli1+細胞是支持種植體骨整合的干細胞［8］，利用Osx-CreERT2小鼠的研究發現成骨細胞特異性轉錄因子（Osterix，Osx）可標記骨發育中的祖細胞［9］。

配對相關同源基因1（paired related homeobox 1，Prrx1）是編碼轉錄因子的同源盒基因，在小鼠間充質中廣泛表達。有研究［10］顯示，Prrx1+細胞在顱頜面及四肢骨骼的發育中均發揮了重要作用。且有學者發現，Prrx1存在于小鼠切牙及磨牙的PDLSCs 中，并參與了小鼠切牙及磨牙的發育、牙周膜的組織修復再生和持續改建的過程［11-12］。因此，本研究基于Cre/loxP 重組酶系統，構建誘導型條件性熒光表達小鼠，并創新性地將細胞譜系示蹤技術與體內OTM 模型相結合，通過免疫熒光染色觀察Prrx1+細胞譜系在正畸應力作用下的動態分布，為今后深入研究Prrx1在牙移動過程中的功能提供新的模型與方法。

1 對象和方法

1.1 實驗動物

6 周齡、雄性誘導型Prrx1-CreERT2小鼠由上海交通大學生命科學技術學院李保界教授惠贈，體質量約20 g。6 周齡、雌性R26tdTomato熒光標記小鼠購買于江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司，體質量為20～25 g，生產許可證：SCXK（蘇）2018-0008。將上述2 種小鼠作為種鼠，以雄性∶雌性=1∶2 進行交配繁殖，獲得的子代小鼠用于后續實驗。

子代小鼠飼養于上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院SPF級動物房，使用許可證：SYXK（滬）2020-0025。飼養條件：溫度（24±2）℃、濕度（60±5）%、12 h晝夜循環、自由飲水，并行常規飼料喂養。

1.2 主要儀器與試劑

PCR 儀（BioRad，美國），凝膠成像系統（GE Healthcare，美國），冰凍切片機（Leica，美國），正置熒光顯微鏡（Olympus，日本）。他莫昔芬（上海昂一生物科技有限公司），DAPI染色液（上海碧云天生物技術有限公司），Alexa Fluor 555 標記的驢抗兔多克隆抗體IgG （Invitrogen，美國），RFP 抗體（Rockland，美國）。

1.3 研究方法

1.3.1 子代小鼠基因型的鑒定 出生2周后，取子代小鼠尾部末端1～2 mm 組織，加入裂解液及蛋白酶K后置于55 ℃恒溫水浴鍋過夜。而后，向其中加入等量異丙醇，出現絮凝的DNA 沉淀后于10 000×g離心10 min，棄上清液，用ddH2O 溶解沉淀。采用常規PCR對小鼠的基因型進行鑒定，引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Tab 1 Primer sequences for PCR

1.3.2 子代小鼠牙周膜中Prrx1+細胞譜系的標記、OTM 模型的構建及分組 取8 只、2 周齡的子代小鼠，于腹腔注射他莫昔芬（10 mg/mL），劑量為200 mg/kg［13］，每間隔2 d 注射1 次，連續注射3 次。如小鼠牙周膜中的Prrx1+細胞譜系均表達tdTomato紅色熒光蛋白，則細胞標記完成（即為tdTomato+細胞）。

當Prrx1+細胞譜系被標記1周后，構建小鼠OTM模型，具體方法參考本課題組的既往報道［14］。即將自制加力裝置的一端結扎固定于左側上頜第一磨牙，另一端結扎后用樹脂固定于上頜切牙；放置加力裝置的一側為OTM 側，未放置的一側為對照側。每日對小鼠口內牙移動裝置是否完整、無脫落檢查1次。

分別于牙移動第3 日（OTM 3 d）、第7 日（OTM 7 d）時處死小鼠（即OTM 3 d 組、OTM 7 d組），收集其雙側上頜第一磨牙及周圍牙周組織，通過體視鏡觀察并測量上頜第一磨牙（M1）及第二磨牙（M2）間距離。

1.3.3 上頜第一磨牙及牙周組織的冰凍切片的獲取 將收集的小鼠雙側上頜第一磨牙及周圍牙周組織浸入4%多聚甲醛中固定，并于4 ℃過夜。次日，將其置于10% EDTA（pH7.4）脫鈣液中進行脫鈣。當上頜第一磨牙可被針尖輕易穿透，視為脫鈣完成。隨后，將其轉入含有20%的蔗糖與2%聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）的混合溶液中進行脫水，再用8%明膠、20%蔗糖和2%PVP的混合冰凍包埋劑進行包埋［15］。使用冰凍切片機在平行于上頜第一磨牙近遠中方向進行連續切片，切片厚度為10～12 μm，用于后續觀察。

1.3.4 冰凍切片的染色分析 采用蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，H-E 染色）對OTM 3 d及OTM 7 d小鼠雙側上頜第一磨牙近中（壓力區）和遠中（張力區）的牙周膜進行觀察。取“1.3.3”制備的冰凍切片進行固定，于蘇木精染液中染色30～60 s，再用1%鹽酸乙醇處理1 s后水洗終止反應。待切片返藍后，加入伊紅染液染色20 s，再依次行乙醇梯度脫水、二甲苯中透明、中性樹脂封片。而后，于光鏡下觀察OTM 3 d、OTM 7 d 小鼠壓力區及張力區中牙周膜的改變。

1.3.5 冰凍切片的免疫熒光染色分析 采用免疫熒光染色對OTM 3 d及OTM 7 d小鼠雙側上頜第一磨牙近中（壓力區）和遠中（張力區）的牙周膜進行觀察。取“1.3.3”制備的冰凍切片，行抗原修復，經磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）清洗后滴加封閉液，于室溫封閉1 h，而后滴加RFP 抗體（1∶1 000） 于4 ℃孵育過夜。次日，加入Alexa Fluor 555 標記的IgG 抗體（1∶1 000）于室溫孵育2 h。采用DAPI染色后封片，于共聚焦顯微鏡下觀察Prrx1+細胞譜系在壓力區及張力區的動態分布。

1.4 統計學方法

所有數據使用SPSS 16.0 軟件進行統計分析。定量資料以表示，采用獨立樣本t檢驗進行2組間比較。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 子代小鼠基因型的鑒定及OTM模型的構建

采用PCR對子代小鼠的基因型進行檢測，結果（圖1）顯示，小鼠基因型為Prrx1-CreERT2；R26tdTomato。

圖1 PCR檢測子代小鼠基因型Fig 1 Detection of genotype of offspring mice by PCR

通過向子代小鼠的腹腔注射他莫昔芬，獲得Prrx1+細胞譜系小鼠。隨后，依據圖2A 所示，建立OTM 模型。所有構建OTM 模型的Prrx1-CreERT2；R26tdTomato小鼠均全程耐受，可自由飲水、進食軟食。于體視鏡下對小鼠OTM 側M1 與M2 間距離進行觀察并測量，結果（圖2B）顯示，OTM 側M1 發生了明顯的近中移動，M1 與M2 間距離隨正畸應力作用時間而增加，即OTM 7 d 時的間隙［（87.44±4.02）μm］大于OTM 3 d 時［（42.81±5.04）μm］。因此，本研究的牙移動規律符合先前的研究報道［16］，表明OTM模型構建成功。

圖2 子代小鼠OTM模型的構建及驗證Fig 2 Construction and validation of OTM model in offspring mice

2.2 壓力區牙周膜的改變及Prrx1+細胞譜系的表達

正畸應力作用下，采用H-E染色對切片的壓力區進行觀察，觀察區域如圖3A 所示。結果（圖3B）顯示：OTM 3 d 時，小鼠OTM 側壓力區的牙周膜間隙變窄、纖維及管腔被壓縮；OTM 7 d 時，OTM 側的牙周膜發生改建，寬度逐漸被恢復。采用免疫熒光染色對OTM 3 d 和OTM 7 d 小鼠的OTM 側及對照側的壓力區tdTomato+細胞數量進行分析，結果（圖3C、3D）顯示：OTM 3 d 小鼠的OTM 側壓力區的牙周膜中tdTomato+細胞數量［（6.35±2.15）%］較對照側［（13.26±3.02）%］有所減少（P=0.007），OTM 7 d小 鼠 的OTM 側tdTomato+細 胞 數 量［ （60.41±4.59）%］較對照側［（20.74±2.62）%］有所增加（P=0.000）；且隨著正畸應力作用時間的增加，OTM側tdTomato+細胞數量亦逐漸增加（P=0.000），在OTM 7 d 時tdTomato+細胞已廣泛分布于壓力區牙周膜內。

圖3 壓力區牙周膜的改變及Prrx1+細胞譜系的表達Fig 3 Changes of periodontal ligament and expression of Prrx1+cell lineage in the compression area

2.3 張力區牙周膜的改變及Prrx1+細胞譜系的表達

正畸應力作用下，采用H-E染色對切片的張力區進行觀察，觀察區域如圖4A 所示。結果（圖4B）顯示：OTM 3 d 時，小鼠OTM 側張力區的牙周膜被拉伸，牙周膜間隙增寬；OTM 7 d 時OTM 側的牙周膜排列較OTM 3 d 時更加規則。采用免疫熒光染色對OTM 3 d 和OTM 7 d 小鼠的OTM 側及對照側的張力區tdTomato+細胞數量進行分析，結果（圖4C、4D）顯示：OTM 3 d 小鼠的OTM 側張力區的牙周膜中tdTomato+細胞數量［（44.48±3.87）%］ 較對照側［（13.64±2.07）%］ 有所增加，OTM 7 d 小鼠的OTM 側tdTomato+細胞數量［（66.88±6.42）%］較對照 側［（20.90±5.78）%］ 亦 有 所 增 加（均P=0.000）；且隨著正畸應力作用時間的增加，OTM 側tdTomato+細胞數量逐漸增多（P=0.001），在OTM 7 d時tdTomato+細胞已廣泛分布于張力區牙周膜內。

圖4 張力區牙周膜的改變及Prrx1+細胞譜系的表達Fig 4 Changes of periodontal ligament and expression of Prrx1+cell lineage in the tension area

3 討論

隨著醫療技術的發展及人民健康意識的增加，牙頜面畸形的診療需求與日俱增。如何安全有效地縮短正畸治療周期、減少正畸復發與并發癥的發生，一直是正畸學者密切關注的熱點。OTM 是基于牙槽骨重塑的過程，骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）及PDLSCs 在其過程中起到了重要作用。BMSCs 是體內骨細胞的主要來源［17］，在應力刺激下可直接誘導成骨向分化，且分化后的成骨細胞會分泌相關因子間接調控破骨細胞；而PDLSCs 是存在于牙周膜中的力學敏感的牙源性間充質干細胞，可直接感知正畸應力并調節破骨細胞的活動，同時其還可在正畸應力下誘導牙周膜的增殖和分化、調節牙周膜穩態［18］。在體內PDLSCs 所處的微環境較為復雜，體外研究尚無法反映該細胞的真實生物學行為，因此在體內對PDLSCs 進行標記與追蹤是研究該細胞在正畸應力下調控牙周改建的前提。

譜系示蹤是一項針對單個細胞及其全部后代細胞進行標記及鑒定，以探究該細胞的譜系發生，并對其后代細胞的數量、位置、分化狀態等進行追蹤觀察的技術。作為譜系示蹤技術中使用較為廣泛的重組酶系統，Cre/loxP 系統可在報告基因前插入loxP-STOPloxP 序列，當Cre 重組酶被激活時，其可切除插入序列中的STOP 序列，使報告基因在所有表達Cre 重組酶的細胞及其后代細胞中表達［19］；同時，Cre重組酶還可與突變的ER（Cre-ER）相結合，當給予他莫昔芬后，Cre-ER 能夠進入細胞核并發揮重組效應，實現對誘導型特異性熒光蛋白的標記［20］。近年來，誘導型細胞譜系示蹤技術已成為研究干細胞譜系發生與轉歸的關鍵技術，這也為本課題組突破現有的牙移動機制研究提供了有力工具。然而在OTM 領域中，鮮少有利用譜系示蹤技術進行研究的報道。

目前，尚未發現PDLSCs 的特異性標志物。既往研究中，部分學者使用軸向抑制蛋白2 （axis inhibition protein 2，Axin2）、Gli1及Prrx1對PDLSCs進行標記。在成牙本質細胞、成牙骨質細胞和成骨細胞中Axin2表達廣泛［21］，使得其對PDLSCs 的特異性不足。而Gli1+及Prrx1+細胞在牙周膜改建、小鼠磨牙生長中發揮了重要作用。其中，Prrx1是編碼轉錄因子的同源盒基因，在顱面部骨骼發育和胚胎肢芽形成中高度表達［22］，敲除Prrx1基因則會導致小鼠牙頜面骨發育障礙［23-26］；同時，Prrx1還參與維持神經干細胞的自我更新能力，高表達于小鼠間充質細胞［27］。這些研究均提示，Prrx1具備干細胞標志物的條件，或參與了牙周組織的發育、穩態維持及修復再生?；诖?，本研究選用Prrx1基因作為小鼠PDLSCs 的研究標志物，構建Prrx1+細胞譜系示蹤小鼠OTM 體內力學模型，追蹤Prrx1+細胞在應力作用下的改變；通過H-E 染色、免疫熒光染色觀察后發現，tdTomato+細胞能夠標記PDLSCs，且OTM 3 d 和OTM 7 d 小鼠的OTM 側張力區tdTomato+細胞數量均較對照側有顯著增加。

本研究成功構建了誘導型Prrx1+細胞譜系示蹤小鼠的牙移動模型，初步證實了Prrx1+細胞譜系參與OTM 的牙周改建。后續，我們將對成骨、破骨及成纖維細胞的標志物進行檢測，對Prrx1+細胞的轉歸行進一步探究。值得注意的是，作為牙源性干細胞，PDLSCs 具有一定的異質性，存在于多個不同的功能亞群。未來，我們還將利用單細胞測序技術，通過轉錄組學對PDLSCs 進行精確分群，并對其組織特異性標志物進行篩選及鑒定，為牙周組織的再生提供新思路。此外，本研究構建的Prrx1-CreERT2；R26tdTomato小鼠還可用于牙周損傷、牙周炎等模型的分析，以標記并追蹤PDLSCs 參與的其他重要生物學過程及譜系轉歸。

綜上，本研究實現了在正畸應力作用下，時空特異性標記、追蹤牙源性干細胞PDLSCs，是國內利用譜系示蹤技術結合OTM 模型的較早探索，或將為牙移動機制研究提供全新的動物模型與較理想的研究策略。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

倫理批準和知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究涉及的所有動物實驗均已通過上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院科學倫理委員會的審核批準（SH9H-2020-A235-1）。所有實驗過程均遵守《關于善待實驗動物的指導性意見》。

All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by Shanghai Ninth People's Hospital，Shanghai Jiao Tong University School of Medicine （Approval Letter No. SH9H-2020-A235-1，dated 03/03/2020），and all experimental animal protocols were carried out by following the guidelines ofInstructive Notions with Respect to Caring for Laboratory Animals.

作者貢獻/Authors'Contributions

汪席均負責實驗、數據整理分析、論文撰寫；金安婷參與論文的寫作和修改；黃湘如負責動物培育及基因型鑒定；徐宏遠、高昕負責資料收集與分析；楊屹羚負責購買試劑、參與實驗分析；代慶剛、江凌勇參與了實驗設計及指導。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The experiment，data compilation and analysis and paper writing were completed by WANG Xijun. The participation in writing and revising was done by JIN Anting. The animal breeding and genotype identification was done by HUANG Xiangru. The data collection and analysis were performed by XU Hongyuan and GAO Xin. The purchase of reagents and the participation in the experimental analysis were done by YANG Yiling. The study was designed by JIANG Lingyong and DAI Qinggang.All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-04-14

·Accepted：2022-08-13

·Published online：2022-08-28

參·考·文·獻

[1] LI Y N, JACOX L A, LITTLE S H, et al. Orthodontic tooth movement: the biology and clinical implications[J]. Kaohsiung J Med Sci,2018,34(4):207-214.

[2] SEO B M, MIURA M, GRONTHOS S, et al. Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament[J].Lancet,2004,364(9429):149-155.

[3] WISE G E, KING G J. Mechanisms of tooth eruption and orthodontic tooth movement[J]. J Dent Res,2008,87(5):414-434.

[4] 趙閆,歐陽寧鵑,代杰文,等. 細胞譜系示蹤技術及其在口腔醫學研究中的應用進展[J]. 口腔生物醫學,2017,8(4):205-210.ZHAO Y,OUYANG N J,DAI J W,et al. Development of cell lineage tracing technology and its application in stomatology research[J]. Oral Biomed,2017,8(4):205-210.

[5] BULTE J W M,DOUGLAS T,WITWER B,et al. Monitoring stem cell therapyin vivousing magnetodendrimers as a new class of cellular MR contrast agents[J]. Acad Radiol,2002,9(Suppl 2):S332-S335.

[6] NAGY A. Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring[J]. Genesis,2000,26(2):99-109.

[7] SHI Y, HE G X, LEE W C, et al. Gli1 identifies osteogenic progenitors for bone formation and fracture repair[J]. Nat Commun,2017,8(1):2043.

[8] YI Y,STENBERG W,LUO W,et al. Alveolar bone marrow Gli1+stem cells support implant osseointegration[J]. J Dent Res, 2022, 101(1):73-82.

[9] MIZOGUCHI T, PINHO S,AHMED J, et al. Osterix marks distinct waves of primitive and definitive stromal progenitors during bone marrow development[J]. Dev Cell,2014,29(3):340-349.

[10] KAWANAMI A, MATSUSHITA T, CHAN Y Y, et al. Mice expressing GFP and CreER in osteochondro progenitor cells in the periosteum[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2009, 386(3):477-482.

[11] BASSIR S H, GARAKANI S, WILK K, et al. Prx1 expressing cells are required for periodontal regeneration of the mouse incisor[J].Front Physiol,2019,10:591.

[12] GONG X Y, ZHANG H, XU X Q, et al. Tracing PRX1+cells during molar formation and periodontal ligament reconstruction[J]. Int J Oral Sci,2022,14(1):5.

[13] ZHONG Z A, SUN W H, CHEN H Y, et al. Optimizing tamoxifeninducible Cre/Loxp system to reduce tamoxifen effect on bone turnover in long bones of young mice[J]. Bone,2015,81:614-619.

[14] DAI Q G, ZHOU S R, ZHANG P, et al. Force-induced increased osteogenesis enables accelerated orthodontic tooth movement in ovariectomized rats[J]. Sci Rep,2017,7(1):3906.

[15] KUSUMBE A P, RAMASAMY S K, STARSICHOVA A, et al.Sample preparation for high-resolution 3D confocal imaging of mouse skeletal tissue[J]. Nat Protoc,2015,10(12):1904-1914.

[16] 孫聰,劉文佳,金巖,等. 小鼠正畸牙齒移動模型的制作[J]. 牙體牙髓牙周病學雜志,2017,27(5):280-283.SUN C, LIU W J, JIN Y, et al. Establishment of mouse model of orthodontic tooth movement[J]. Chin J Conserv Dent, 2017, 27(5):280-283.

[17] ABDALLAH B M, KASSEM M. Human mesenchymal stem cells:from basic biology to clinical applications[J]. Gene Ther, 2008,15(2):109-116.

[18] WANG K, XU C, XIE X, et al. Axin2+PDL cells directly contribute to new alveolar bone formation in response to orthodontic tension force[J]. J Dent Res,2022,101(6):695-703.

[19] KIM H, KIM M, IM S K, et al. Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of target genes[J]. Lab Anim Res,2018,34(4):147-159.

[20] FEIL R, BROCARD J, MASCREZ B, et al. Ligand-activated sitespecific recombination in mice[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1996,93(20):10887-10890.

[21] XIE X, WANG J, WANG K, et al. Axin2+-mesenchymal PDL cells,instead of K14+epithelial cells, play a key role in rapid cementum growth[J]. J Dent Res,2019,98(11):1262-1270.

[22] LI B, WANG Y G, FAN Y, et al. Cranial suture mesenchymal stem cells:insights and advances[J]. Biomolecules,2021,11(8):1129.

[23] MARTIN J F, BRADLEY A, OLSON E N. The paired-like homeo box gene MHox is required for early events of skeletogenesis in multiple lineages[J]. Genes Dev,1995,9(10):1237-1249.

[24] LU M F, CHENG H T, KERN M J, et al.Prx-1functions cooperatively with another paired-related homeobox gene,prx-2, to maintain cell fates within the craniofacial mesenchyme[J].Development,1999,126(3):495-504.

[25] MITCHELL J M, HICKLIN D M, DOUGHTY P M, et al. ThePrx1homeobox gene is critical for molar tooth morphogenesis[J]. J Dent Res,2006,85(10):888-893.

[26] BALIC A, ADAMS D, MINA M N. Prx1 and Prx2 cooperatively regulate the morphogenesis of the medial region of the mandibular process[J]. Dev Dyn,2009,238(10):2599-2613.

[27] WANG J, SARASWAT D, SINHA A K, et al. Paired related homeobox protein 1 regulates quiescence in human oligodendrocyte progenitors[J]. Cell Rep,2018,25(12):3435-3450.e6.