鹽酸法舒地爾脂質體的制備及其對炎性內皮細胞的改善作用*

莫瑩瑩，李京濤，梁彬彬，吳 棘

（廣西醫科大學第一附屬醫院超聲科，南寧 530021）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種危害人類健康的慢性心血管疾病，是導致冠心病、腦梗死和外周血管疾病的高危因素[1-2]。RhoA/ROCK通路調節細胞功能，包括細胞遷移、應力纖維形成、收縮性和膜突起，導致AS進展[3]。鹽酸法舒地爾是目前應用于臨床的RhoA/ROCK 通路選擇性阻斷劑，在臨床上對于心絞痛、腦動脈及冠狀動脈痙攣等心腦血管疾病有較好的治療效果[4-5]。但鹽酸法舒地爾生物利用性低，體內半衰期短[6]，治療指數也隨之降低。脂質體是臨床上應用最成功的納米藥物載體[7]，在腫瘤等疾病的臨床治療中得到應用，其具有靶向性、緩釋性、提高藥物穩定性、降低藥物毒性等優點[8]。目前國內、外對于鹽酸法舒地爾脂質體的制備工藝的優化及其作用評價研究較少，本研究擬優化鹽酸法舒地爾脂質體的制備方法，并評價其對于血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）誘導人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）的炎性保護作用，為AS的預防及治療提供新的選擇。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 RE-52AA型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；超聲波細胞破碎儀（Bioruptor Plus，比利時）；Nicomp PSS 380ZLS 激光納米粒度儀（美國）；EVOS FL Auto 顯微鏡（美國Life Technologies公司）；超高速冷凍離心機（BECKMAN COULTER，美國）；全波長酶標讀數儀（Multiskan GO，美國Thermo）；Countstar 自動細胞計數儀（IC1000，中國上海）；UV-2550紫外分光光度計（日本島津）。

1.2 主要試劑 膽固醇、二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）、CCK8試劑盒、細胞間黏附分子-1（ICAM-1）試劑盒、血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基（DSPE-PEG2000-COOH）（湖南華騰制藥有限公司）；鹽酸法舒地爾原料藥（上海源葉生物科技有限公司）；即用型CE 膜透析袋（美國光譜醫學公司）；HUVECs 及內皮細胞專用培養基ECM（美國Sciencell 公司）；Ang Ⅱ（美國Sigma 公司）；DiI 熒光染料試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；一氧化氮（NO）測定試劑盒（南京建成生物有限公司）。

1.3 鹽酸法舒地爾脂質體的制備 采用薄膜分散法制備鹽酸法舒地爾脂質體。按一定比例稱量DPPC、膽固醇、DSPE-PEG2000-COOH，將混合物用氯仿水浴超聲充分溶解，置于旋轉蒸發器35 ℃減壓旋轉蒸發使其在瓶底形成均勻的薄膜，放在真空干燥機中干燥過夜。通過主動載藥法或被動載藥法來包載藥物。被動載藥法中，用PBS緩沖液稀釋的鹽酸法舒地爾并結合水浴超聲將瓶底的薄膜水化成懸濁液，用超聲細胞破碎儀超聲10 min（4 ℃，5 s/5 s，on/off，320 W，60 個循環），在4℃超聲后用3 000 r/min 離心去除大分子物質，立即吸取上清液轉移至透析袋內（透析袋截留分子量1 000 D），用PBS緩沖液透析24 h以除去未包封的藥物。用同樣的方法制備空白對照脂質體（脂質體內包封的是PBS緩沖液）。主動載藥法中，先用醋酸鈣溶液水化干燥的薄膜成懸濁液并用0.9%氯化鈉溶液透析至適宜的跨膜梯度，將藥物在一定溫度下孵育，用超聲細胞破碎儀均一粒徑后離心并透析。制備的脂質體在4 ℃下保存，以備后續研究。

1.4 鹽酸法舒地爾脂質體的質量評價 取少量制備好的鹽酸法舒地爾脂質體，光學顯微鏡下觀察其形態及分布情況，PSS 納米粒度儀測定脂質體的平均粒徑及平均電位。

用直接法測定載藥脂質體的包封率，10μL 脂質體經990 μL 甲醇裂解后超聲30 min，離心（10 000 r/min，10 min），將藥物從脂質體中分離，用紫外分光光度計在320 nm 測定上清液中鹽酸法舒地爾的含量，可得到包封于脂質體內法舒地爾的質量，同時將一定量制備好的鹽酸法舒地爾脂質體凍干并稱量，即可得鹽酸法舒地爾脂質體總質量，根據以下公式計算包封率和載藥量：包封率（%）=包封于脂質體內的法舒地爾質量/投入的法舒地爾總質量；載藥量（%）=包封于脂質體內的法舒地爾質量/鹽酸法舒地爾脂質體總質量。

在透析袋內加入2 mL鹽酸法舒地爾脂質體，放入50 mL 離心管內，加入20 mL PBS 緩沖液（pH=7.4），于37 ℃搖床（100 r/min）進行釋放實驗。分別于0.2 h、0.4 h、0.8 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、12 h、24 h取樣5 mL，同時補充等量的PBS緩沖液。用同體積PBS 稀釋的鹽酸法舒地爾作鹽酸法舒地爾組。用紫外分光光度計（320 nm）測量取出藥物濃度，計算藥物累積釋放率。

1.5 體外細胞攝取 采用流式細胞儀檢測細胞的攝取情況。配制濃度為10 μmol/L的DiI熒光染料，將鹽酸法舒地爾脂質體與DiI 染料避光孵育20 min，于4 ℃下12 000 r/min離心10 min，除去游離染料，沉淀重懸即制成帶熒光的脂質體。將HUVECs接種于6孔板中，待細胞生長貼壁80%～90%后，加入500 μL 熒光脂質體及1 mL 完全培養基，同時設空白對照孔（只加完全培養基），孵育2 h 后PBS 沖洗3 次，胰酶消化，1 000 r/min 離心3 min，PBS 重懸后用流式細胞儀檢測熒光強度。

1.6 實驗分組 將HUVECs細胞隨機分為4組，（1）對照組：培養液中只加等量的培養液；（2）AngⅡ組：培養液中加入10-7mol/L Ang Ⅱ；（3）載藥脂質體組：培養液中加入0.1 mg/mL鹽酸法舒地爾脂質體培養8 h，再加入10-7mol/L Ang Ⅱ繼續培養；（4）空白脂質體組：培養液中加入0.1 mg/mL 空白法舒地爾脂質體培養8 h，再加入10-7mol/L Ang Ⅱ繼續培養。

1.7 CCK8 法檢測細胞活力 將HUVECs 細胞接種于96孔板中，取對數生長期細胞，用胰酶消化，完全培養基配制成細胞懸液，待細胞生長貼壁80%～90%后，分組處理細胞（每組6個副孔），另設空白調零孔（不加細胞只加培養液），培養24 h后每孔加入CCK8 緩沖液10μL，同樣條件下繼續培養2 h 于酶標儀檢測450 nm處吸光值。

1.8 細胞培養上清液NO 含量檢測 將HUVECs細胞接種于6 孔板中，分組處理后，收集細胞培養液。采用硝酸還原法測定細胞培養上清液中NO含量。操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.9 細胞培養上清液VCAM-1、ICAM-1含量檢測 將HUVECs細胞接種于6孔板中，分組處理后，收集細胞培養液。采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法測定細胞培養上清液中VCAM-1和ICAM-1蛋白水平。操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.10 統計學方法 采用SPSS 25.0 統計軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗，方差不齊采用Dunnett’s T3 檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 鹽酸法舒地爾脂質體制備的優化 在醋酸鈣濃度120 mmol/L、孵育時間30 min、孵育溫度60 ℃條件下，不同藥脂比的主動載藥法（即醋酸鈣梯度法）包封率較被動載藥法升高（P＜0.01），見表1。

表1 主動載藥法與被動載藥法包封率比較，n=3

表1 主動載藥法與被動載藥法包封率比較，n=3

與被動載藥法比較，#P＜0.01。

在相同的條件下，隨著醋酸鈣濃度增高，脂質體的包封率也逐漸增高；相同條件下藥脂比為1∶15時包封率最高，加大藥物投放時包封率逐漸下降；相同條件下孵育時間為30 min時包封率最高，當孵育時間延長至90 min 時，包封率下降；相同條件下孵育溫度在60 ℃時包封率最高，見表2。綜合考慮制備成本及脂質體穩定性的問題，最終的制備方案為醋酸鈣梯度法，醋酸鈣濃度120 mmol/L，藥脂比為1∶10，孵育時間30 min，孵育溫度60 ℃，所制備的脂質體包封率為（91.48±5.64）%，載藥量為（41.86±2.35）%。

表2 相同條件下不同醋酸鈣濃度、不同藥脂比、不同孵育時間和不同孵育溫度包封率比較，n=3

表2 相同條件下不同醋酸鈣濃度、不同藥脂比、不同孵育時間和不同孵育溫度包封率比較，n=3

a 條件為藥脂比1∶10，孵藥時間30 min，孵藥溫度60 ℃；b條件為醋酸鈣濃度120 mmol/L，孵藥時間30 min，孵藥溫度60 ℃；c條件為醋酸鈣濃度120 mmol/L，藥脂比1∶10，孵藥溫度60 ℃；d 條件為醋酸鈣濃度120 mmol/L，藥脂比1∶10，孵藥時間30 min。

2.2 鹽酸法舒地爾脂質體表征 光學顯微鏡下可見鹽酸法舒地爾脂質體分布均勻（圖1）。激光納米粒度儀測定結果顯示：載藥脂質體的平均粒徑為（185.12±20.90）nm，粒徑分布均勻（圖2），平均電位為（-25.22±1.23）mV，表面較高的負電產生靜電排斥作用，避免了脂質體之間發生聚集現象，有利于脂質體的物理穩定性。

圖1 光鏡下鹽酸法舒地爾脂質體形態分布（×400）

圖2 鹽酸法舒地爾脂質體粒徑分布

2.3 脂質體體外模擬釋放實驗結果 鹽酸法舒地爾在1 h 釋藥72.63%，在5 h 基本釋放全部的藥物，達到平臺期；而鹽酸法舒地爾脂質體在1 h 僅釋放37.93%，12 h 達到平臺期，24 h 可釋放87.62%的藥物，從而達到緩釋效果，見圖3。

圖3 體外模擬釋藥曲線

2.4 細胞攝取 流式細胞儀檢測顯示熒光強度約為39.30%，說明脂質體可被細胞攝取，見圖4。

圖4 流式細胞儀檢測HUVECs對脂質體的攝取率

2.5 脂質體對Ang Ⅱ誘導的內皮細胞活力影響 對照組細胞存活率為100%，Ang Ⅱ組細胞存活率為（69.31±3.00）%，載藥脂質體組細胞存活率為（88.38±1.86）%，空白脂質體組細胞存活率為（67.92±3.98）%。與對照組比較，Ang Ⅱ組、載藥脂質體組、空白脂質體組細胞存活率均降低（均P＜0.01，n=6）；與Ang Ⅱ組比較，載藥脂質體組細胞存活率升高（P＜0.01，n=6）。

2.6 各組內皮細胞培養上清液NO、VCAM-1、ICAM-1含量比較 與對照組比較，Ang Ⅱ組、載藥脂質體組、空白脂質體組NO 含量降低，ICAM-1、VCAM-1 含量升高（均P＜0.01）；與Ang Ⅱ組比較，載藥脂質體組NO 含量升高，VCAM-1、ICAM-1 含量降低（均P＜0.01）；空白脂質體組與Ang Ⅱ組NO、VCAM-1 和ICAM-1 含量比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 各組HUVECs細胞培養上清液NO、ICAM-1、VCAM-1含量比較，n=6

表3 各組HUVECs細胞培養上清液NO、ICAM-1、VCAM-1含量比較，n=6

與對照組比較，#P＜0.01；與Ang Ⅱ組比較，*P＜0.01。

3 討論

目前，靶向給藥已成為疾病治療領域的研究熱點，脂質體日益被視為靶向藥物傳遞系統的理想載體[9]。由于鹽酸法舒地爾是弱酸性親水分子（pH 為4.5～6.0），在脂類制劑中包封的效率較低，主動載藥法可高效提高弱酸或弱堿性的親水性藥物的包封率。醋酸鈣梯度法屬于主動載藥法中的一種，其有利于弱酸性藥物的脂質體包載，醋酸鈣梯度可誘導產生pH 梯度，高效驅動弱酸性藥物使其從脂質體的外水相主動進入到內水相，因此達到優化包封率的效果[10]。本研究通過比較被動和主動載藥法，改變藥脂比、醋酸鈣濃度、孵藥時間及溫度，優化了鹽酸法舒地爾在脂質體中的包封率，使其成為包封率及載藥量高的納米制劑，并可成功被HUVECs攝取。緩釋效應是脂質體制劑的重要特征之一，可延長藥物的消除半衰期，延長血液循環時間，提高藥物利用率和藥物治療指數。鹽酸法舒地爾在人體內的半衰期相對較短，約為2～3 h 左右，藥效持續時間較短。本研究體外模擬釋藥結果表明，與鹽酸法舒地爾比較，鹽酸法舒地爾脂質體的緩釋特征更為明顯。

RhoA/ROCK 通路參與AS 炎性反應的多個階段[11-13]。血管氧化應激反應和NO在AS的早期發展中起到關鍵的作用[14]，內皮一氧化氮合酶（eNOS）生物活性減低是內皮功能損傷的表現[15]，在生理條件下eNOS 產生NO。炎癥因子如ICAM-1、VCAM-1通過促進細胞黏附，參與AS發展的全過程[16]。鹽酸法舒地爾通過特異性抑制RhoA/ROCK 信號通路，抑制炎癥細胞浸潤，減少炎癥介質的產生，并上調eNOS 表達，促進NO 生成。Ang Ⅱ在AS 病理生理中起著核心作用[17]。Ang Ⅱ作為血管活性肽，對于血管的影響包括調節內皮功能、氧化應激、炎癥、細胞遷移和增殖[18]，并通過促進斑塊的破裂和高血栓的形成狀態加速AS 進展。研究表明，Ang Ⅱ可破壞HUVECs活力、功能及細胞骨架等，在AS發生和發展中起著重要作用[19]。本研究采用Ang Ⅱ誘導HUVECs 成功建立炎性細胞模型，載藥脂質體組與Ang Ⅱ組比較，NO 含量升高，VCAM-1、ICAM-1 含量降低，表明載藥脂質體中釋放的鹽酸法舒地爾能夠對Ang Ⅱ誘導的炎性內皮細胞起到保護及改善作用?？瞻字|體組與Ang Ⅱ組比較，未見明顯差異，表明空白脂質體對于炎性細胞無明顯改善作用。

綜上，本研究所制備的鹽酸法舒地爾脂質體對炎性內皮細胞有保護作用，可降低其炎性反應及Ang Ⅱ對內皮細胞的損害。