瑞香素對坐骨神經慢性壓迫性損傷誘導大鼠神經病理性疼痛的作用及其機制*

張 奕，賈蔓箐，劉園園，劉 軍

（新疆醫科大學第七附屬醫院藥學部，烏魯木齊 830028）

神經病理性疼痛（NP）是一種由體感神經系統損傷或功能障礙引起的以痛覺超敏、痛覺過敏、自發性疼痛和感覺異常為特征的慢性疼痛。據統計，NP 在成年人中的患病率為7%，嚴重影響患者的生活質量[1]。NP的病因復雜，其診斷和治療仍是目前臨床面臨的難題[2]。近年來有研究發現，脊髓內星形膠質細胞和小膠質細胞的偶聯改變在NP的發生中起著關鍵作用[3]?；罨男切文z質細胞和小膠質細胞可能通過促進炎性細胞因子和趨化因子釋放誘發局部神經炎癥，使神經元致敏，從而促進NP的產生[4]。而阻斷促炎趨化因子的分泌或維持促炎細胞因子與抗炎細胞因子的平衡能夠減輕疼痛超敏反應[5]。以上研究結果提示，活化的膠質細胞調節炎癥反應可能是NP的重要發病機制之一。

瑞香素（DAPH）是從瑞香中提取的主要活性成分，具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤和鎮靜、鎮痛等廣泛的生物活性，已被臨床用于治療炎癥性疾病[6]。動物實驗表明，DAPH 對伴有慢性疼痛的實驗性自身免疫性腦脊髓炎和類風濕性關節炎均具有良好的改善作用[7-8]。此外，DAPH 透皮貼片可減輕醋酸誘導的小鼠疼痛[9]。然而，DAPH 的鎮痛作用，尤其在慢性炎性疼痛方面的作用及其機制尚未明確?；诖?，本研究通過采用坐骨神經慢性壓迫性損傷（CCI）誘導大鼠NP，探索DAPH在慢性炎性疼痛中的作用及相關分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級SD 雄性大鼠60 只，8～10 周齡，體重250～280 g，購于新疆醫科大學實驗動物中心，合格證號：SCXK（新）2018-0002。動物飼養于標準動物房，以標準飼料喂養，自由飲水、進食。

1.2 實驗試劑與儀器 DAPH（純度≥98%，規格：20 mg）購自成都艾博克生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒、RIPA 裂解液、ECL 均購自合肥萊爾生物科技有限公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-1β、IL-6酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒購自武漢艾迪抗生物科技有限公司；鼠抗膠質原纖維酸性蛋白（GFAP）單克隆抗體、鼠抗鈣離子接頭蛋白1（Iba-1）單克隆抗體均購自上海碧云天生物科技有限公司；兔抗硫氧還蛋白相互作用蛋白（TXNIP）單克隆抗體、兔抗Nod 樣受體蛋白3（NLRP3）單克隆抗體、兔抗凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）單克隆抗體、兔抗含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1（Caspase-1）單克隆抗體、鼠抗β-actin單克隆抗體、HRP 標記的抗鼠IgG 和抗兔IgG 抗體均購自艾博抗（上海）貿易有限公司。

BW-EVF2393型電子Von Frey測痛儀購自上海阮隆科技發展有限公司；BME-410C 型全自動足底鎮痛測試儀購自上海玉研科學儀器有限公司；自動凝膠成像分析系統購自美國Thermo Fisher Scientific公司；CX43熒光顯微鏡購自南京貝登醫療股份有限公司；SuPerMax 3100 型多功能酶標儀購自上海閃譜生物科技公司。

1.3 NP大鼠模型的建立[10]腹腔注射戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉并固定大鼠，用止血鉗鈍性分離股二頭肌暴露坐骨神經，采用4-0 鉻制羊腸線在坐骨神經主干中部進行4 圈環形結扎，每圈結扎間隔1 mm 的距離，術畢逐層縫合傷口，并腹腔注射100 mg/mL氨芐青霉素預防感染。若大鼠患肢足趾并攏且呈輕度外翻，出現蜷縮、跛行、自發性抬足等現象，機械縮足反射閾值（MWT）明顯降低，縮足反射潛伏期（TWL）明顯縮短，即說明CCI 誘導的NP大鼠模型構建成功。

1.4 實驗分組與處理 將60只大鼠隨機分為假手術組、模型組、DAPH低劑量組（DAPH-L組）、DAPH高劑量組（DAPH-H 組），每組15 只。模型組、DAPH-L 組、DAPH-H 組均建立NP 模型，假手術組手術操作同模型組但不結扎坐骨神經。DAPH-L組和DAPH-H 組分別灌胃給予30 mg/kg 和90 mg/kg的DAPH[11]，假手術組和模型組灌胃給予等量生理鹽水。術后第1天開始給藥，連續14 d。

1.5 大鼠疼痛行為測定 分別于術前1 d 和術后1 d、3 d、7 d、14 d進行MWT和TWL測試。（1）MWT測試：將大鼠置于有機玻璃室內30 min以適應測試環境，隨后用不同壓力的von Frey 纖維絲刺激大鼠患肢足底中部，刺激強度由小到大，每種強度刺激重復5 次，每次刺激保持3～5 s，每兩次刺激間隔時間為30 s。記錄誘發大鼠縮足反應≥3 次時的壓力值，記為陽性反應。MWT 測試重復10 次，取平均值。（2）TWL測試：使用全自動足底鎮痛測試儀測量大鼠足底對熱刺激的敏感性。將大鼠置于3 mm厚的玻璃板表面，玻璃板上覆蓋有機玻璃室，輻射熱源位于玻璃板下方固定距離處，熱刺激直接作用于左后爪的暴露部位，記錄誘發大鼠頻繁抬足、舔足等現象的時間。測試儀切斷時間設置為30 s，以避免組織損傷。每隔5 min 進行5 次熱刺激，取平均值。

1.6 標本采集 疼痛行為測試結束后，麻醉大鼠，經心臟灌注生理鹽水，分離大鼠L5 背根神經節（DRG）組織和L4～L6節段之間的脊髓組織，保存備用。

1.7 ELISA法檢測大鼠脊髓組織中炎癥因子水平 取大鼠L4～L6 段脊髓組織，加入預冷的PBS，4 ℃、8 000 r/min 離心10 min，收集上清液，用酶標儀檢測450 nm 處的吸光度值，繪制標準曲線，計算大鼠脊髓組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平。檢測過程嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.8 免疫熒光染色法檢測大鼠脊髓組織中GFAP和Iba-1 表達水平 取大鼠脊髓組織，置于4%多聚甲醛中，4 ℃冰箱固定過夜，30%蔗糖溶液脫水，取組織制備16 μm厚的冰凍切片，PBS漂洗3次，每次5 min。加入含有0.3%Triton X-100的5%山羊血清封閉液，室溫封閉2 h，清除血清，加入一抗GFAP（1∶1 000）、Iba-1（1∶1 000）稀釋液4 ℃冰箱孵育過夜，PBS 漂洗3 次，每次5 min；滴加二抗，室溫避光孵育2 h，DAPI 染色，PBS 充分漂洗，滴加抗熒光猝滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照，采用Image J圖像分析軟件分析GFAP和Iba-1的熒光強度。

1.9 Western blotting 法檢測TXNIP、NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表達 取大鼠DRG 組織，加入RIPA裂解緩，冰上裂解，提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。用10%SDS-PAGE 電泳分離蛋白，將蛋白轉移到PVDF 膜，加入5%脫脂奶粉，室溫封閉2 h；加入一抗TXNIP、NLRP3、ASC、Caspase-1、β-actin（均1∶1 000）4 ℃冰箱孵育過夜，洗膜，加入HRP標記的二抗（1∶1 000）室溫孵育2 h，ECL顯影，Image J軟件分析目的蛋白條帶灰度值。

1.10 統計學方法 采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況及體重變化 各組大鼠術后均未感染，切口愈合良好，精神狀況佳，飲水、進食正常，體重無明顯差異（P＞0.05），見圖1。模型組、DAPH-L 組、DAPH-H 組大鼠術后1～3 d 出現跛行、左后肢負重困難等現象，在術后3～14 d 表現明顯。

圖1 各組大鼠體重變化

2.2 各組大鼠MWT 和TWL 比較 術前1 d，各組MWT和TWL比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；術后1 d、3 d、7 d、14 d，與假手術組比較，模型組MWT 和TWL 降低（P＜0.05）；與模型組比較，DAPH-L 組 和DAPH-H 組 術 后3 d、7 d、14 d 時MWT 和TWL 升高，且DAPH-H 組高于DAPH-L 組（均P＜0.05），見圖2。

圖2 各組大鼠MWT和TWL比較

2.3 各組大鼠脊髓組織中炎癥因子水平比較 與假手術組比較，模型組大鼠脊髓組織中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，DAPH-L 組和DAPH-H 組大鼠脊髓組織中TNF-α、IL-1β和IL-6水平降低，且DAPH-H組低于DAPH-L組（均P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠脊髓組織中炎癥因子水平比較pg/mL，

表1 各組大鼠脊髓組織中炎癥因子水平比較pg/mL，

與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與DAPH-L組比較，&P＜0.05。

2.4 各組大鼠脊髓組織中GFAP 和Iba-1 表達水平比較 與假手術組比較，模型組大鼠脊髓組織中GFAP 和Iba-1 熒光強度增強，GFAP 和Iba-1 表達水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，DAPH-L 組和DAPH-H組大鼠脊髓組織中GFAP和Iba-1熒光強度減弱，GFAP和Iba-1表達水平降低，且DAPH-H組低于DAPH-L組（均P＜0.05），見圖3。

圖3 免疫熒光染色檢測大鼠脊髓組織中GFAP和Iba-1表達（×200）

2.5 各組大鼠DRG 中TXNIP、NLRP3、ASC 和Caspase-1 蛋白表達比較 與假手術組比較，模型組大鼠DRG中TXNIP、NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，DAPH-L 組和DAPH-H 組大鼠DRG 中TXNIP、NLRP3、ASC 和Caspase-1 蛋白表達水平降低，且DAPH-H 組低于DAPH-L組（均P＜0.05），見圖4。

圖4 各組大鼠DRG中TXNIP、NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表達比較

3 討論

DAPH 是一種天然香豆素衍生物，在心血管疾病、炎癥性疾病的治療中有著良好的效果[12]。Qi等[13]研究發現，DAPH 可通過調節MAPK 信號通路和HSP70 表達保護氧化應激誘導的神經元凋亡。Zhi等[14]報道，DAPH通過激活海馬神經元Nrf2/HO-1信號通路保護海馬神經元免受氧氣葡萄糖剝奪誘導的損傷。DAPH 可通過抑制炎癥反應、單胺氧化酶A 介導的神經遞質損耗和氧化應激減輕利血平所致小鼠纖維肌痛[15]。DAPH 還可通過調控Nrf2/HO-1/NF-κB 信號通路抑制脊髓膠質細胞活化，從而減輕弗氏完全佐劑誘導的炎性疼痛[16]。NP 屬于慢性炎癥性疼痛。本研究中，CCI誘導的NP大鼠術后出現明顯的機械超敏反應和熱超敏反應，經DAPH干預后，NP大鼠機械超敏反應和熱超敏反應明顯減輕，且DAPH 高劑量改善大鼠疼痛效果顯著優于DAPH低劑量。證實DAPH能夠有效改善NP，且其作用效果與藥物劑量相關。

周圍神經損傷激活小膠質細胞和星形膠質細胞，導致神經營養因子如腦源性神經營養因子（BDNF）和促炎細胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等釋放增多，從而啟動病理疼痛過程[17-18]。Iba-1 是小膠質細胞活化的特定標志物，GFAP 是星形膠質細胞活化的生物標志物，抑制Iba-1和GFAP表達可有效抑制小膠質細胞和星形膠質細胞激活。CCI可引起脊髓背角小膠質細胞和星形膠質細胞活化，促進Iba-1 和GFAP 過度表達，抑制脊髓背角中Iba-1 和GFAP 的過度表達可緩解CCI 誘導的NP[19]。TNF-α在促進神經性疼痛的發展中發揮著重要作用，在周圍神經損傷誘導的神經性疼痛模型中，DRG和脊髓背角中TNF-α表達上調，阻斷TNF-α信號可減輕硼替佐米誘導的神經性疼痛[20]。IL-1β 是疼痛信號轉導的重要因子，其由活化的巨噬細胞以原蛋白的形式表達，經Caspase-1 蛋白水解生成成熟片段。IL-1β 成熟片段能夠引起初級感覺神經元的神經纖維敏感，進而引起疼痛超敏。抑制IL-1β 表達可減輕CFA誘導的炎性疼痛[21]。IL-6也與多種病因引起的NP有關。紅核中IL-6通過激活JAK/STAT3和ERK信號通路參與神經損傷誘導的NP，并通過誘導TNF-α 和IL-1β 產生維持NP[22]。本研究結果顯示，CCI 誘導的NP 大鼠脊髓組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平以及GFAP、Iba-1表達水平均升高，DAPH干預后NP 大鼠脊髓組織中促炎細胞因子及GFAP 和Iba-1 表達水平均明顯降低。表明DAPH 能夠抑制CCI 誘導的脊髓小膠質細胞和星形膠質細胞激活，并減少大鼠脊髓促炎細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的產生。

TXNIP廣泛表達于多種細胞中，是內源性清除活性氧的蛋白硫氧還蛋白的抑制劑，也是調節能量代謝過程中氧化應激和炎癥的重要分子營養傳感器，其與脊髓或腦損傷、神經退行性疾病的發生有關[23]。NLRP3 炎性小體在先天免疫和炎癥中起著至關重要的作用，NLRP3可通過ASC募集Caspase-1前體，活化Caspase-1，誘導炎癥因子表達。NLRP3的激活受多種細胞蛋白或因子的影響。TXNIP 與NLRP3 結合是NLRP3 炎性小體形成和激活所必需的關鍵信號機制。TXNIP/NLRP3 炎性小體軸已被證實在海馬損傷、腦缺血卒中、脊髓損傷等中樞神經系統功能障礙或疾病中發揮重要作用[24-25]。Hu等[26]報道，抑制TXNIP/NLRP3炎性小體軸的激活能夠減輕CCI 引起的脊髓背角神經元丟失，從而減輕CCI 誘導的NP。本研究結果顯示，CCI 誘導的NP大鼠DRG 中TXNIP 蛋白表達水平升高，TXNIP 通過與NLRP3 形成復合體激活NLRP3 炎性小體，促進ASC 和Caspase-1 蛋白表達，而DAPH 能夠顯著下調NP 大鼠DRG 中TXNIP、NLRP3、ASC 和Caspase-1 蛋白表達。提示DAPH 改善CCI 誘導的NP，可能與抑制TXNIP/NLRP3炎性小體軸激活有關。

綜上所述，DAPH 通過阻斷星形膠質細胞和小膠質細胞的活化抑制炎癥反應，進而減輕周圍神經損傷誘導的NP，其作用機制可能與抑制TXNIP/NLRP3炎性小體軸的活化有關。