基于PI3K/Akt/mTOR途徑研究芒果苷對糖尿病誘導視網膜微血管損傷的保護作用及機制*

華炳紅，李馥伶，陳 琳

（1.中南大學湘雅醫學院附屬?？卺t院內分泌代謝科，?？?570203；.中南大學湘雅醫學院附屬?？卺t院藥學部，?？?570203）

糖尿病視網膜?。╠iabetic retinopathy，DR）是糖尿病的常見并發癥[1]。據估計，到2030 年全球DR 患者的數量將達到1.91 億[2]。高血糖介導的毛細血管損傷引起視網膜缺血缺氧以及玻璃體岀血，進而發生增殖性視網膜病變，最終導致失明[1]。目前的主要治療干預措施仍無法完全避免并發癥[3]。DR 的主要病理特征為視網膜血管閉塞性循環障礙，以及內皮細胞增殖、遷移和血管形成[4]，因此，抑制視網膜血管新生是治療DR的重要手段。

芒果苷是一種雙苯毗酮類黃酮類免疫調節化合物，具有抗腫瘤、抗感染、降血糖、抗氧化和免疫調節等多種藥理作用[5]。研究發現，芒果苷對鏈脲菌素（STZ）誘導的糖尿病大鼠血液生化參數能夠發揮保護作用[6]。然而，芒果苷對糖尿病高糖（HG）和缺氧環境誘導的視網膜毛細血管內皮細胞（RRCEC）損傷是否具有保護作用尚未完全清楚。因此，本研究旨在探討芒果苷對RRCEC 細胞暴露于HG/缺氧環境后增殖、遷移和血管新生能力的影響及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑 大鼠RRCEC（Procell Life Science，美國）。DMEM 細胞培養基和胎牛血清（FBS）（Clark Bioscience，美國）；芒果苷、青霉素/鏈霉素雙抗、D-（+）-葡葡萄和二甲基亞砜（DMSO）試劑（Sigma Aldrich，美國）；細胞計數試劑盒（CCK-8）（Abcam公司，英國）；磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白質絲蘇氨酸激酶（AKT）信號通路抑制劑LY294002和激活劑胰島素樣生長因子（IGF-1）（Sigma Aldrich，美國）；抗血管內皮生長因子（VEGF）抗體、抗缺氧誘導因子-lα（HIF-lα）抗體、抗PI3K 抗體、抗AKT 抗體、抗雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抗體、抗PI3K 磷酸化抗體、抗AKT 磷酸化抗體和抗mTOR磷酸化抗體（Abcam，英國）。

1.2 細胞培養 RRCEC細胞培養在含10%FBS和1%青霉素/鏈霉素的高糖DMEM 培養基中，放入含有5%CO2的37°C全濕度恒溫細胞培養箱內培養。

1.3 實驗分組和處理 將RRCRC 細胞分為9 組：對照組、HG/缺氧組、芒果苷低濃度（0.05 mmol/L）組、芒果苷中濃度（0.1 mmol/L）組、芒果苷高濃度（0.2 mmol/L）組、芒果苷中濃度+LY294002組、芒果苷中濃度+IGF-1 組、HG/缺氧+LY294002 組和HG缺 氧+IGF-1 組。各組處理如下：HG/缺氧組RRCEC 細 胞接種于含有D-（+）-葡萄糖（30 mmol/L）的DMEM 培養基中，置于37 ℃缺氧（1%、94%N2和5%CO2）培養箱內培養；芒果苷低、中、高濃度組在HG 缺氧環境中預處理后，在培養基中分別加入0.05 mmol/L、0.1 mmol/L和0.2 mmol/L芒果苷。芒果苷中濃度+LY294002 組在細胞培養基中加入0.1 mmol/L 芒果苷和PI3K/AKT 信號通路抑制劑（LY294002，40 μmol/L）；芒果苷中濃度+IGF-1組在培養基中加入0.1 mmol/L芒果苷和PI3K/AKT通路激活劑（IGF-1，100 ng/mL）；HG/缺氧+LY294002組和HG/缺氧+IGF-1 組按上述劑量分別在培養基中加入LY294002 和IGF-1，均37 ℃下干預24 h。對照組細胞用相同濃度DMSO處理。

1.4 Western blotting 檢測HIF-1α、VEGF、p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K和p-mTOR/mTOR蛋白表達 將RRCEC 細胞接種于6 孔板中（1×106個/孔），如前所述處理。PBS 清洗3 次，每孔加入90 μL 裂解緩沖液+10 μL蛋白酶抑制劑對樣本進行勻漿，冰上裂解30 min。4 ℃下12 000 r/min 離心20 min。BCA 法檢測樣本蛋白含量，煮沸變性。應用SDS-PAGE 凝膠對40 μg 總蛋白進行電泳。濕轉將蛋白轉移至PVDF 膜上，8%脫脂牛奶封閉非特異性蛋白1 h，4 ℃下分別用抗VEGF（1∶1 000）、抗HIF-lα（l∶500），抗PI3K（1∶1 000）、抗AKT（1∶10 000）、抗mTOR（1∶1 000）、抗p-PI3K（1∶500）、抗p-AKT（1∶5 000）、抗p-mTOR（1∶1 000）和抗β-actin（1∶1 000）抗體孵育過夜。隨后，將膜與山羊抗兔IgG二抗（1∶2 000）或山羊抗鼠IgG二抗（1∶2 000）在室溫下孵育1 h，采用ECL 化學發光法顯示蛋白條帶，Image-Pro Plus 6.0進行灰度分析。

1.5 CCK-8 實驗評估細胞增殖 芒果苷的最佳濃度參照文獻[7]。RRCEC 細胞在HG 和缺氧預處理后，用芒果苷分別在37 ℃進行濃度梯度（0.01 mmol/L、0.1 mmol/L、l mmol/L和10 mmol/L）和時間梯度（24 h、48 h、72 h）干預。根據CCK-8 試劑盒說明書，以每孔1 500個細胞接種于96孔板內，每個濃度設置6 個復孔。細胞按照上述方式處理后，每孔加入CCK-8 試劑，混勻后在37 ℃細胞培養箱內繼續培養1.5 h。采用酶標儀檢測450 nm 波長處各孔的吸光度值（OD值）。

1.6 成管實驗評估血管新生 96 孔板每孔中加入60 μL 預先冷卻的Matrigel 基質膠，37 ℃凝固1 h。各組細胞胰酶消化后計數，每孔加入細胞（5×104個/mL），缺氧條件下培養6 h，然后轉移到常氧條件下培養12 h。用芒果苷（0.05 mmol/L、0.1 mmol/L 和0.2 mmol/L）在缺氧條件下處理細胞24 h，利用倒置相差顯微鏡，在5 個隨機選擇的視野中觀察血管生成情況。

1.7 劃痕實驗評估細胞遷移 各組RRCEC細胞接種于6 孔板中（5×105個細胞/孔）。100%聚集后，用無菌微量移液槍頭在每個細胞單層上整齊劃岀劃痕，PBS清洗除去細胞碎片。用芒果苷（0.05 mmol/L、0.1 mmol/L和0.2 mmol/L）在37 ℃和缺氧條件下處理細胞24 h。使用倒置相差顯微鏡在24 h內3個不同時間點觀察劃痕的恢復程度。

1.8 統計學方法 采用SPSS 26.0統計學軟件對數據進行分析。計量資料以均數±標準差（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey's post hoc檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 芒果苷對HG/缺氧誘導的RRCEC活性和增殖的影響 與對照組相比，0.01～10 mmol/L 濃度芒果苷均可抑制RRCEC的活性（P＜0.001），具有濃度依賴性；隨著芒果苷干預時間的增加，細胞活性逐漸增加（P＜0.001）；但0.1 mmol/L芒果苷處理48 h時，與對照組相比，細胞活力未見明顯改變（P＞0.05），見圖1A。CCK8結果顯示，與對照組相比，HG/缺氧組RRCEC 細胞增殖能力明顯增強（P＜0.05），而與HG/缺氧組相比，芒果苷各濃度組對RRCEC細胞增殖能力均無明顯差異（P＞0.05），見圖1B。

圖1 芒果苷對HG/缺氧誘導的RRCEC細胞活性和增殖的影響

2.2 芒果苷對HG/缺氧誘導的RRCEC細胞遷移能力的影響 劃痕實驗結果顯示，與對照組相比，HG/缺氧組細胞相對遷移距離顯著增加（P＜0.01）；與HG/缺氧組相比，芒果苷低、中、高濃度組細胞遷移距離減少（P＜0.05），各芒果苷濃度組間比較差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 芒果苷對HG/缺氧誘導的RRCEC細胞遷移的影響（×50）

2.3 芒果苷對HG/缺氧誘導的RRCEC細胞血管新生的影響 成管實驗結果顯示，與對照組相比，HG/缺氧組微管長度變長，分支數增多，血管新生能力顯著增強（P＜0.05）；與HG/缺氧組相比，芒果苷中、高濃度組細胞中HIF-1α 和VEGF 的蛋白表達均降低（P＜0.01），見圖3。

圖3 芒果苷對HG/缺氧誘導的RRCEC細胞血管新生的影響

2.4 芒果苷可抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路的活性 與對照組相比，HG/缺氧組細胞中p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K 和p-mTOR/mTOR 的比值升高（P＜0.05）；與HG/缺氧組相比，芒果苷中濃度組p-AKT/AKT、p-PI3K/ PI3K 和p-mTOR/mTOR 的比值下降（P＜0.05），芒果苷低濃度組僅p-PI3K/PI3K 的比值下降（P＜0.05），而芒果苷高濃度組與HG/缺氧組相比無明顯差異（P＞0.05），見圖4。

圖4 芒果苷抑制HG/缺氧誘導的RRCEC細胞中PI3K/AKT/mTOR信號通路激活

2.5 PI3K/AKT/mTOR激動劑和抑制劑對HG/缺氧誘導的RRCEC細胞遷移和血管生成的影響 劃痕實驗（圖5A）結果顯示，與HG/缺氧組相比，芒果苷中濃度組和HG/缺氧+LY294002 組RRCEC 遷移能力減弱（P＜0.05）；與芒果苷中濃度組相比，芒果苷中濃度+LY294002 組細胞遷移能力減弱（P＜0.05）。而與HG/缺氧組相比，HG/缺氧+IGF-1 組細胞的遷移能力增強（P＜0.05）；與芒果苷中濃度組相比，芒果苷中濃度+IGF-1 組細胞遷移增強（P＜0.05）。成管實驗（圖5B）表現岀與遷移實驗相似的結果，與HG/缺氧組相比，芒果苷中濃度組和HG/缺氧+LY294002 組分支點數量減少；與芒果苷中濃度組相比，芒果苷中濃度+LY294002 組分支點數減少。而與HG/缺氧組相比，HG/缺氧+IGF-1 組新生血管和分支點數增多；芒果苷中濃度+IGF-1組血管新生較芒果苷中濃度組增加。

圖5 PI3K/AKT/mTOR激動劑和抑制劑對HG/缺氧誘導的RRCEC細胞遷移和血管生成的影響

3 討論

長期暴露于高血糖和缺氧環境被認為是DR血液-視網膜屏障和微血管損傷的主要原因[8]。由于DR 的發病機制復雜，目前的治療干預措施無法完全避免DR 的發生。因此，探索DR 的病理機制，尋找新型藥物來降低DR的發病率和致盲率己成為當前重要的研究方向。DR病理改變的主要原因是糖尿病導致的微血管內血流動力學異常對視網膜微血管的損害。由于糖尿病對血管和血液因素的影響導致視網膜微血管閉塞，發展為視網膜缺血缺氧，引起視網膜釋放大量血管生長因子，通過內皮細胞的缺氧信號促進血管內皮細胞的增殖和遷移，從而引起新生血管的形成[4]。鑒于此，本研究將RRCEC 置于HG/缺氧環境中，模擬DR 體外細胞模型，研究在不同條件下RRCEC細胞增殖、遷移和血管新生的變化。結果發現，在HG/缺氧條件下RRCEC細胞的增殖、遷移和血管新生能力均明顯高于對照組，這些結果與DR的主要病理特征相符。

芒果苷是一種天然的多酚酸類化合物，廣泛存在于漆樹科芒果的果實、葉、皮中。研究發現，芒果苷對高血糖和糖尿病表現岀明顯的藥理保護作用，可減少糖尿病大鼠血清中炎癥因子的釋放，抑制氧化應激，同時能夠顯著改善糖尿病患者的胰島素敏感度和血糖水平[9]。Deng 等[10]研究發現，芒果苷可通過阻斷PI3K/AKT 通路抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[10]。但芒果苷與糖尿病HG/缺氧環境誘導的視網膜微血管內皮損傷之間的關系尚未可知。內皮細胞增殖和遷移是血管生成的標志之一。本研究結果顯示，芒果苷（0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L）對HG/缺氧誘導的RRCEC 增殖活性未表現出抑制作用，但可明顯降低RRCEC的遷移和新生血管形成。這與Daud 等[11]的研究結果一致，體外實驗中芒果苷可增加主動脈內皮細胞的遷移，但對細胞增殖沒有影響。

HIF-lα 是調控缺氧的重要因子，可作為轉錄因子與VEGF 啟動子結合，促進腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲和血管新生[12]。VEGF作為目前發現最強的促血管生成因子，參與視網膜和脈絡膜血管新生[13]。而且，HIF-1α 和VEGF 的表達在介導活躍的視網膜血管生成和緩解DR的進展中發揮主要作用。臨床試驗也證實，抗血管內皮生長因子藥物可用于治療眼部疾病的血管生成。本研究發現，芒果苷對HG/缺氧誘導RRCEC 細胞的管腔形成具有明顯的抑制作用；中濃度和高濃度芒果苷治療后，HIF-lα 和VEGF 蛋白表達較HG/缺氧組明顯降低，然而低濃度芒果苷對此未產生明顯影響，因此合適濃度的芒果苷可顯著降低HG/缺氧誘導RRCEC細胞遷移。

PI3K/AKT/mTOR 信號通路在多種血管疾病中發揮促進作用[14]。磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸在PI3K催化下生成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3），激活下游AKT 的磷酸化，進而激活mTOR[15]。PI3K/AKT/mTOR信號通路在調節DR中的HIF-1α/VEGF信號表達中起著至關重要的作用[16]。值得注意的是，Sasore 等[14]報道，PI3K/AKT/mTOR 信號通路通過誘導視網膜細胞的增殖、凋亡、遷移和血管生成來促進DR的發生、發展；芒果苷可通過激活大腦中的PI3K/AKT/mTOR 信號通路減少氧化應激，對腦血管內膜產生保護作用。鑒于此，本課題組推測芒果苷可能通過調節PI3K/AKT/mTOR信號通路來防止DR 過程中視網膜毛細血管內膜增生。結果發現，相較于HG/缺氧組，中濃度芒果苷干預可顯著降低p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K 和p-mTOR/mTOR 的比值。表明芒果苷可通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活緩解HG/缺氧誘導的視網膜毛細血管損傷，中濃度（0.1 mmol/L）可能是最適濃度。高濃度芒果苷并沒有降低HG/缺氧誘導的RRCEC 細胞中PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平。筆者推測高濃度芒果苷可能激活或抑制其它上游信號通路，以降低PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平。因此，需要進一步實驗證實高濃度芒果苷對PI3K/AKT信號通路上游成分的影響。本研究還發現，給予RRCEC細胞PI3K/AKT 信號通路特異性抑制劑LY294002處理，可產生與芒果苷同樣的效果，進一步對細胞的遷移和血管新生能力產生抑制作用。IGF-1 對PI3K/AKT信號通路的激活則可明顯減弱芒果苷對RRCEC 細胞遷移和血管新生的保護作用。以上結果表明，PI3K/AKT/mTOR 信號通路在糖尿病誘導的視網膜微血管損傷中發揮重要的調節作用，而中濃度芒果苷可通過此途徑對HG/缺氧誘導的RRCEC細胞損傷產生較好的保護作用。

綜上所述，芒果苷可以通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路，顯著降低HG/缺氧誘導的RRCEC細胞遷移和血管生成能力，芒果苷可能是治療DR的有效藥物。