廣西某高校細胞培養實驗室污染狀況的調查研究*

鐘偉月，黃海燕，馮 燚，彭遠軍，廖艷研,3，王海龍,3，梁敏莉，林成琳，楊 揚，葉 力1,,3，潘沛江,3△，梁 浩1,,3△

（1.廣西醫科大學公共衛生學院 廣西艾滋病防治研究重點實驗室，南寧 530021；2.廣西醫科大學生命科學研究院生物安全三級實驗室，南寧 530021；3.中國（廣西）-東盟新發傳染病聯合實驗室，南寧 530021）

細胞培養實驗室污染仍是目前普遍存在的問題。在細胞培養等實驗過程中，試劑容器表面、環境以及實驗人員操作等因素會造成污染，如支原體污染、細菌污染等[1]，可導致細胞功能和性質發生改變，從而影響實驗研究的準確性和科學性[2]。支原體污染是最常見、不易察覺和干擾實驗結果的污染原因[3]，調查顯示細胞系的支原體污染率在15%～50%[4]，受支原體污染的細胞可能無明顯變化，但可使研究結果的真實性和可靠性大大下降[1]。細胞培養實驗在生物安全柜內操作，生物安全柜是一種由特殊氣流組織結構與高效空氣過濾器組成的具有箱型屬性特點的凈化功能負壓裝置[5]，但其本身存在使用年限過長、過濾裝置損壞等問題而達不到相應的保護效果。此外，客觀條件如實驗室清潔情況、人員無菌意識、實驗操作是否恰當等，均可能對細胞造成污染[6]。因此，對于實驗室環境的污染檢測，在日常的細胞培養過程中是十分必要的。本研究通過結合細胞培養實驗室的客觀條件如人員流動情況、清潔制度等，并采集細胞培養實驗室外環境樣本與生物安全柜表面樣本，檢測支原體與細菌污染情況，為促進實驗室的規范管理提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM 培養液和胎牛血清（Gibco公司），15 mL和1.5 mL的EP管（Labselect公司），直徑90 mm培養皿（Biosharp公司），營養瓊脂粉劑（北京陸橋技術股份有限公司），PCR 擴增試劑（Takara公司）。

1.2 采樣對象及方法 隨機抽取8 個細胞培養實驗室進行采樣，每個實驗室均有紫外燈、制冷及新風系統，其中6 個實驗室設置緩沖間。每個實驗室分布10 個采樣點，其中包括生物安全柜下方落腳處、顯微鏡旁臺面、培養箱內壁、培養箱外側扶手、培養箱內用水、房間地面中央及4 處角落。對安全柜的采樣分為紫外照射30 min、無人員操作運行30 min與人員操作30 min后不同時間點，在生物安全柜操作臺面兩側及中間3個采樣點進行采樣。細菌采樣以醫用滅菌級棉簽蘸取采樣液（生理鹽水4 mL）、支原體采樣使用醫用滅菌級棉簽蘸取采樣液（含2%FBS的DMEM培養液1 mL），生理鹽水和DMEM培養液均進行滅菌處理。

將酒精燈點燃并置于采樣點附近（≤15 cm），先將5 cm×5 cm 不銹鋼采樣板經火焰進行滅菌，冷卻后采樣板置于采樣點保持不動，使用滅菌棉簽在采樣板中間5 cm×5 cm 范圍內進行涂抹后，迅速將棉簽置于相應的采樣管中。

1.3 細菌與支原體檢測方法 將采集的生理鹽水標本短暫渦旋10 s，充分混勻后取1 mL混懸液至無菌培養皿中，置入高壓后的營養瓊脂培養基，于生化培養箱中培養48 h，觀察平板上細菌生長情況并計數。DMEM 培養液標本置于37 ℃、5%CO2的培養箱中培養7 d，用PCR 擴增法以及瓊脂糖凝膠電泳技術檢測支原體污染情況。采用兩對引物對支原體的不同片段進行擴增，引物1 上游：5’-GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT-3’，下游：5’-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3’；引 物2上游：5’-GGCGAATGGGTGAGTAACACG-3’，下游：5’-CGGATAACGCTTGCGACCTATG-3’。PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35 個循環；72 ℃，10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳（120 mA，30 min）后于凝膠檢測儀中觀察是否出現相應的擴增產物的條帶以判斷是否存在支原體感染。

1.4 統計學方法 采用SPSS 23.0統計軟件進行統計分析。計量資料為開口資料，采用中位數（M）表示，行秩和檢驗；計數資料以百分率（%）表示，率的比較采用Fisher確切概率法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗室不同采樣點的污染情況 對每個實驗室的10個不同采樣點進行采樣并檢測細菌、支原體污染情況，細菌培養結果如表1所示，房間4個角落及地面中央、安全柜下方落腳處、培養箱外側扶手以及內壁的樣本均可檢出細菌，樣本陽性檢出率為100.00%。僅在1 個實驗室培養箱水樣檢出細菌。各個采樣點均受到不同程度的支原體污染，其中支原體陽性檢出率最高的位置是培養箱水樣，為100.00%，房間地面中央的標本支原體陽性檢出率最低，為50.00%，見表2。

表1 實驗室不同采樣點的細菌污染情況CFU/皿

表2 實驗室不同采樣點的支原體污染情況

2.2 不同類型實驗室的污染情況 將所采樣的8 間實驗室按照實驗操作人員數大小分為A、B 兩組，A組為實驗人員數較少組，B組為實驗人員數較多且流動頻繁組，比較兩組污染情況的差異。如表3 所示，B 組實驗室的房間角落1、3、4 及地面中央，以及安全柜落腳處的細菌數目均多于A 組（P＜0.05）。A 組實驗室安全柜落腳處的支原體陽性檢出率高于B組（P＜0.05），見表4。

表3 不同類型實驗室的細菌污染情況CFU/皿，M

表4 不同類型實驗室的支原體陽性檢出情況n（%）

2.3 生物安全柜內污染情況 對采樣的細胞培養平臺中安全柜內臺面上從左到右布置3個采樣點進行采樣，共采集了36份樣本并予以細菌培養計數和支原體檢測，檢測結果如表5所示，所有樣本均未培養出細菌。通過對支原體污染狀況進行檢測，發現采樣點1在人員操作30 min后支原體陽性檢出率為25.00%，采樣點2 在風機運行30 min、人員操作30 min 后支原體陽性檢出率分別為25.00%、25.00%，采樣點3 在紫外照射30 min 后支原體陽性檢出率仍有25.00%?？梢?，經過紫外照射30 min、風機空運行30 min、人員操作30 min 后生物安全柜內仍存在一定的支原體污染。

表5 生物安全柜內樣本陽性檢出率%

3 討論

細胞培養實驗室環境分為實驗室外環境和生物安全柜內環境。實驗室外環境因人員流動頻繁，是空氣污染的易感區和高發區，可通過消毒、殺菌與值日打掃來提高其清潔度[5]。本研究結果顯示，實驗人員流動頻繁的公共實驗室房間地面與安全柜落腳處細菌污染較嚴重。除房間地面中央以外的其余9 個采樣點支原體陽性檢出率均超過60.00%，這可能與實驗室人員流動性較大以至于管理難度大，以及實驗室未定期開展清潔消毒有關。高校微生物實驗室由于學生流動性大，進出人員多，實驗人員衣物表面的微生物會導致實驗室環境污染[7]。減少實驗人員的活動，對各種實驗用品進行表面消毒可減少空氣細菌污染[8]。因此，應合理安排實驗室的使用，如盡量減少無關人員進出實驗室，進入操作間前必須穿工作服，定期打掃衛生，定期使用紫外燈光照射進行滅菌處理等并加強督導，讓學生能從自我防范和維護實驗室安全滅菌環境的意識上來重視實驗室的生物安全管理[2]。

本研究結果顯示，細胞培養箱水樣的支原體陽性檢出率高達100.00%，這可能與實驗室的日常清潔制度不力，清潔效果未達標有關。二氧化碳培養箱污染是導致細胞培養失敗的一個主要因素[9]，為減少和防止污染的發生，培養箱的消毒和維護尤為重要，日常細胞培養箱內所加入的水必須是蒸餾水或去離子水，除需經常檢查箱內水是否足夠外，還應定期更換培養箱用水，并對培養箱進行清潔消毒，防止箱內微生物滋生。

進入安全柜內的空氣經過高效過濾裝置（HEPA）過濾后達到百級潔凈，可降低氣溶膠擴散現象，減少實驗室感染現象[10]，然而一旦生物安全柜的有效性和安全性遭到破壞，將對實驗室以及實驗物品、實驗結果造成嚴重污染。另外，有研究表明實驗室內生物安全柜使用過久，濾板未定期更換或長久不更換，過濾裝置受塵埃堵塞，污染空氣進入操作區，從而導致柜內污染[11]，因此日常定期監測生物安全柜內污染狀況顯得十分重要。本研究發現，經過紫外照射30 min、風機空運行30 min 后支原體陽性檢出率仍為25.00%，可見抽檢實驗室的生物安全柜存在一定程度的污染，這可能與生物安全柜的日常維護不規范有關。在使用頻率較高的場所，一般一至兩年后HEPA的通透性會隨著其表面積累的灰塵、細菌而下降，進而影響生物安全柜的垂直風速和窗口平均風速，使安全柜內的潔凈、無菌環境以及實驗人員的安全無法得到正常保障[6]。因此，實驗管理人員應做好生物安全柜的維修保養，每年對其有效性和安全性進行檢測，如及時更換高效空氣過濾器，準確測量流經HEPA的氣流速度及負壓等。

有研究報道，在生物安全柜動態條件下，如操作不當，人員的實驗活動會造成操作面板及格柵部位的空氣亂流，實驗室外環境中的部分非潔凈空氣就會隨空氣亂流進入實驗區域造成實驗樣本污染[10]。本研究結果顯示，在人員操作30 min 后采樣點1 和采樣點2 的支原體陽性檢出率均為25.00%，這可能與實驗人員的操作不當有關。雷亞克等[12]研究表明，在實驗人員手接觸最為頻繁的地方污染最為嚴重，實驗室內環境污染可能多由手部衛生措施不到位和常態化的清潔消毒不徹底所造成的。因此，為避免柜內空氣亂流和實驗樣本交叉污染，實驗人員應養成良好的操作習慣，如佩戴口罩、頭套、滅菌手套，以及穿好滅菌實驗服等。

綜上所述，不論是實驗室外環境還是生物安全柜內環境均有不同程度的污染，應加強完善實驗室管理制度，定期檢修生物安全柜，實驗人員注意無菌操作，做好實驗物品表面消毒和規范操作，有助于降低細胞培養實驗室的污染。