莪術醇提物乳膏通過JAK/STAT3通路對銀屑病大鼠皮膚病理改變的影響

姚孝林

（上海朗沁生物科技有限公司，上海 200235）

銀屑病是一種常見的慢性復發性炎癥性皮膚病，臨床表現多為鱗屑性紅斑。銀屑病具有發病率高、病程長、病情反復且難以治愈等特點，再加上瘙癢和疼痛等問題，給患者的身心帶來了極大的傷害[1]。目前臨床上治療銀屑病的常用療法有局部治療、光療、生物制劑等，但均有明顯的不良反應。中醫復方治療具有療效確切、副作用小等臨床優勢，在銀屑病治療領域日益受到重視。本研究通過建立銀屑病動物模型，研究莪術醇提物乳膏通過Janus 激酶/ 信號轉導和轉錄激活因子（JAK/STAT3）通路對銀屑病大鼠皮膚病理改變的影響?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇SD 健康大鼠48 只，雌雄各半，由基爾頓生物科技有限公司提供。鼠齡3 ～6 個月，平均（3.81±1.53）個月；體重200 ～250g，平均體重（220.21±7.86）g；飼養溫度22℃～25℃，室內濕度35% ～40%。動物室均經過定時紫外線照射消毒。所有動物均給予標準飼料喂養，飼養時間均為1 周。動物可以自由飲水及活動。

1.2 試驗藥物

莪術來源于四川新荷花中藥飲片有限公司。莪術醇提取乳膏的制備：取50g 莪術粉放置于錐形瓶中，加入250mL 甲醇，超聲攪拌10 min×3 次，取上清液離心（1500rpm，10 min），再向錐形瓶中加入250mL甲醇，超聲攪拌10 min，靜置4h，取上清液離心，將2 次離心液合并，用旋轉蒸發器回收甲醇，水浴溫度45℃。50% 乙醇洗出，水浴蒸發除去乙醇，得到棕紅色黏稠液體，即得到莪術醇提取物5.6g[1]。乳膏基質的制備：取單硬脂酸甘油酯70g、硬脂酸140g、白凡士林85g、十六醇20g、羥苯乙酯1g、乙醇8mL，混合加熱至70℃，制成油相。將甘油85g、十二烷基硫酸鈉10g 溶解于適量的純化水中，加熱至70℃，制成水相，然后將油相緩慢加入水相中，不停攪拌，制成乳膏基質[1]。莪術醇提物乳膏的制備：分多次在莪術醇提物中加入乳膏基質，并攪拌均勻，得到黃色乳膏。然后分別制成兩種莪術醇提取乳膏。每克乳膏相當于莪術生藥1.0g、2.0g，劑量按原生藥g/kg 計算[1]。

1.3 試驗方法

1.3.1 分組及制造模型 將48 只大鼠隨機分成空白對照組、銀屑病組、莪術醇提物乳膏（1 g/kg）組、莪術醇提物乳膏（2 g/kg）組，每組12 只。參照魏榮等[2]的研究方法建立銀屑病大鼠模型，將所有大鼠背部中間2cm×4cm 區域的毛發全部剔除，然后按照0.05g/cm2的標準將藥膏均勻涂抹至已經剔除毛發的區域，空白對照組大鼠毛發剔除區均勻涂抹凡士林乳膏，銀屑病組、莪術醇提物乳膏（1 g/kg）組、莪術醇提物乳膏（2 g/kg）組大鼠剃除的毛發區域均勻涂抹咪喹莫特乳膏（生產廠家：天方藥業有限公司；批準文號：國藥準字H20031230），每天1 次，連續涂抹14 d，使其產生銀屑病皮損樣病理改變。如果在建模過程中大鼠背部的毛發重新長出，則重復進行剃毛處理[1-3]。

1.3.2 給藥 建模成功后，空白對照組、銀屑病組不作處理，莪術醇提物乳膏（1 g/kg）組、莪術醇提物乳膏（2 g/kg）組每天涂抹給藥1 次，以覆蓋創面為宜。

1.3.3 收集標本 各組大鼠飼養到既定時間，均以頸椎脫位法處死。將大鼠背部皮膚組織分成2 份，其中一份標本在10% 的甲醛溶液中進行固定，經過修塊、流水沖洗、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋等操作后制備成石蠟切片，測定大鼠背部皮膚損傷表皮厚度、Baker 病理評分、炎癥細胞計數，并通過蘇木素- 伊紅（HE）染色觀察病理組織的病變情況；另一份標本置于液氮中冷凍保存，用以后續的指標檢測[4]。

1.4 檢測指標與方法

1.4.1 HE 染色及背部皮膚損傷表皮厚度的檢測 將制備的大鼠背部皮損組織在10% 甲醛溶液中進行固定、脫水、透明、浸蠟包埋、脫蠟、HE 染色，然后在顯微鏡下觀察大鼠背部皮膚損傷組織的病理學表現，使用IPP6.0 軟件測量表皮厚度[2,5]。

1.4.2 Baker 病理評分 Baker 病理評分標準：角質層：出現小膿瘍：2 分；角化不完全：1 分；過度角化：0.5分。表層：表層中有顆粒細胞層消失：1 分；棘層肥厚：1 分。真皮層： 毛細血管擴張：1.5 分；出現單一多核細胞浸潤，根據嚴重程度分為重度、中度、輕度，分別計2 分、1 分、0.5 分[1,6]。

1.4.3 炎癥細胞計數 Baker 病理評分完成后，使用光學顯微鏡對大鼠背部皮膚組織進行攝片，采用Imagepro-plus6.0 圖像分析系統對所選視野中的炎癥細胞進行計數[1,7]。

1.4.4 背部皮膚組織中白細胞介素-17（IL-17）、IL-22、IL-23、γ- 干擾素（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達水平的檢測 取液氮冷凍保存的皮膚組織，采用酶聯免疫吸附試驗檢測，將標本用胞被液〔 PH9.5，0.05mol/L 磷酸鹽緩沖液（CB）〕適當稀釋至30mL，添加至聚苯乙烯反應板孔中，溫度4℃，反應24h。第二日使用洗滌劑洗滌3 次，甩干，在各孔中加入稀釋液（PH7.4，0.02mol/L，Tris-HCI 緩沖液）稀釋的待測標本0.1mL，同時加入陽性和陰性的對照標本，置于43℃下1h。液體除去后洗滌3 次，甩干。在各個孔中加入底物液〔 0.1 mol/L Na2HPO4（Na2HPO4·12H2O35.8 g/L） 〕 5.14 mL、0.05 mol/L 枸櫞酸（10.5 g/L）4.86 mL 混勻，加入鄰苯二胺（OPD）4 mg，置棕色小瓶中，臨用時加30%H2O24.0μL，混勻 0.1 mL，黑暗環境下放置20 min，在各孔中加入 2 mol/L H2SO40.05 mL，終止反應。在酶標儀上讀取 A405 吸收值，分析IL-17、IL-22、IL-23 、IFN-γ、TNF-α 的表達水平[2,8]。

1.4.5 背部皮膚組織IL-6 受體/JAK/STAT3（IL-6R/JAK/STAT3）通路因子mRNA 表達量檢測 取液氮冷凍保存的大鼠背部皮膚組織，加入 1 mL Trizol 研磨為粉末狀，按照制備試劑盒說明書提取大鼠背部皮膚組織中的總RNA，之后對RNA 純度、含量進行檢測，使用Takara 逆轉錄試劑盒行逆轉錄處理后獲得c DNA，之后使用Prim-er5.0 軟件對引物序列進行設計，使用逆轉錄- 聚合酶鏈反應（RT-PCR）方法檢測大鼠背部皮膚組織中IL-6R/JAK/STAT3 通路因子mRNA 表達量，采用2-△△Ct方法計算出需要檢測的IL-6R、JAK1、STAT3、CD80、CCL5 mRNA 表達量[2,9]。

1.5 統計學方法

采用Excel 統計數據，以Graph Pad Prim 6.0 及SPSS 19.0 統計分析作圖，計量數據以±s表示，符合正態分布者采用t檢驗或方差分析，非正態分布者采用Spearman 秩相關分析，P＜0.05 表示差異有統計學意義[10]。

2 結果

2.1 各組大鼠表皮厚度、炎癥細胞浸潤數量、Baker評分的比較

由表1 可見，銀屑病組、莪術醇提物乳膏（1 g/kg）組及莪術醇提物乳膏（2 g/kg）組大鼠的表皮厚度、炎癥細胞浸潤數量、Baker 評分均明顯高于空白對照組，P＜0.05。銀屑病組的上述三項評價指標均明顯高于兩個莪術醇提物乳膏組。此外，莪術醇提物乳膏（2 g/kg）組的上述三項評價指標均明顯低于莪術醇提物乳膏（1 g/kg）組，P＜0.05。

表1 各組大鼠表皮厚度、炎癥細胞浸潤數量、Baker 評分的比較（± s，n=12）

表1 各組大鼠表皮厚度、炎癥細胞浸潤數量、Baker 評分的比較（± s，n=12）

組別 表皮厚度（μmol） 炎癥細胞浸潤數（個） Baker 病理評分（分）空白對照組 8.31±0.24 31.01±1.23 1.29±0.02銀屑病組 78.12±3.24 98.23±24.14 6.55±1.23莪術醇提物乳膏（1 g/kg）組 52.21±2.34 62.34±6.20 4.63±1.01莪術醇提物乳膏（2 g/kg）組 45.23±2.08 52.93±4.23 3.25±1.09 t/P 值 54.231/0.001 25.345/0.001 5.136/0.001

2.2 各組大鼠背部皮膚組織中IL-17、IL-22、IL-23、IFN-γ、TNF-α 表達水平的比較

由表2 可見，銀屑病組、莪術醇提物乳膏（1 g/kg）組及莪術醇提物乳膏（2 g/kg）組大鼠背部皮膚組織中IL-17、IL-22、IL-23、IFN-γ、TNF-α 的 表 達水平均明顯高于空白對照組，P＜0.05。銀屑病組的上述評價指標均明顯高于兩個莪術醇提物乳膏組。此外，莪術醇提物乳膏（2 g/kg）組的上述評價指標均明顯低于莪術醇提物乳膏（1 g/kg）組，P＜0.05。

表2 各組大鼠背部皮膚組織中IL-17、IL-22、IL-23、IFN-γ、TNF-α 表達水平的比較（pg/g，± s ，n=12）

表2 各組大鼠背部皮膚組織中IL-17、IL-22、IL-23、IFN-γ、TNF-α 表達水平的比較（pg/g，± s ，n=12）

組別 IL-17 IL-22 IL-23 IFN-γ TNF-α空白對照組 1.72±0.01 3.12±0.26 5.68±0.25 17.23±4.23 69.02±12.34銀屑病組 2.98±0.27 5.31±0.26 8.23±1.02 38.82±6.82 182.16±20.12莪術醇提物乳膏（1 g/kg）組 2.56±1.04 4.01±0.59 7.23±0.92 30.32±4.23 140.24±21.01莪術醇提物乳膏（2 g/kg）組 2.01±0.19 3.31±0.13 6.99±0.78 27.72±4.21 131.01±10.23 t/P 值 1.023/0.001 2.047/0.001 3.245/0.001 13.931/0.001 56.234/0.001

2.3 各組大鼠背部皮膚組織中IL-6R/JAK/STAT3通路因子mRNA 表達水平的比較

由表3 可見，銀屑病組、莪術醇提物乳膏（1 g/kg）組及莪術醇提物乳膏（2 g/kg）組大鼠背部皮膚組織中IL-6R/JAK/STAT3 通路因子mRNA 的表達水平均明顯高于空白對照組，P＜0.05。銀屑病組的上述評價指標均明顯高于兩個莪術醇提物乳膏組。此外，莪術醇提物乳膏（2 g/kg）組的上述評價指標均明顯低于莪術醇提物乳膏（1 g/kg）組，P＜0.05。

表3 各組大鼠背部皮膚組織中IL-6R/JAK/STAT3 通路因子mRNA 表達水平的比較（± s，n=12）

表3 各組大鼠背部皮膚組織中IL-6R/JAK/STAT3 通路因子mRNA 表達水平的比較（± s，n=12）

組別 IL-6R JAK1 STAT3 CD80 CCL5空白對照組 0.21±0.02 0.15±0.02 0.18±0.02 0.01±0.01 0.34±0.06銀屑病組 0.34±0.12 0.31±0.07 0.31±0.07 0.22±0.04 0.59±0.13莪術醇提物乳膏（1 g/kg）組 0.31±0.14 0.28±0.02 0.28±0.03 0.18±0.02 0.52±0.17莪術醇提物乳膏（2 g/kg）組 0.27±0.02 0.24±0.03 0.25±0.01 0.13±0.03 0.46±0.01 t/P 值 0.025/0.001 0.027/0.001 0.019/0.001 0.124/0.001 0.863/0.001

3 討論

銀屑病是在遺傳或環境等因素的刺激下，由免疫介導的慢性炎癥性皮膚病，其病程長，易復發，難根治。此病患者的臨床表現多以鱗屑、紅斑為主，病變多發生于頭皮、四肢伸側，嚴重影響患者的身心健康。目前銀屑病的發病機制還不明確，但發病群體多為人類。因此理想的動物模型對研究銀屑病的發病機制及治療方案至為重要。本文通過建立大鼠銀屑病模型，探索莪術醇提物乳膏對銀屑病皮膚病理改變的影響。實驗結果顯示，銀屑病組、莪術醇提物乳膏（1 g/kg）組及莪術醇提物乳膏（2 g/kg）組大鼠的表皮厚度、炎癥細胞浸潤數量、Baker 評分、IL-17、IL-22、IL-23、IFN-γ、TNF-α 表達水平、IL-6R/JAK/STAT3 通路因子mRNA 表達水平均明顯高于空白對照組，P＜0.05。銀屑病組的上述評價指標均明顯高于兩個莪術醇提物乳膏組。此外，莪術醇提物乳膏（2 g/kg）組的上述評價指標均明顯低于莪術醇提物乳膏（1 g/kg）組，P＜0.05。分析本實驗結果可知，銀屑病典型的組織病理學表現主要為角化過度或不全，炎癥細胞浸潤。有研究表明，銀屑病患者的相關因子，如IL-17A、IL-17F 及IL-23R都是受到STAT3 轉錄激活，STAT3 是銀屑病治療中的重要靶點之一[11]。莪術醇提物乳膏可能通過激活JAK/STAT3 信號傳導通路來發揮降低相關炎性因子表達水平的作用。

綜上所述，莪術醇提物乳膏對銀屑病皮膚病理改變有明顯改善作用，其作用機制可能與細胞因子以及免疫表達相關。