基于網絡藥理學的玄參-麥冬藥對治療糖尿病作用機制研究

陳燦燦，黃柳倩，王晨曦

（1.廣州中醫藥大學第四臨床醫學院，廣東 深圳 518033；2.廣州中醫藥大學第五臨床醫學院，廣東 廣州 510405）

糖尿?。―iabetes Mellitus, DM）是一組由胰島素分泌異常所引起的，以慢性高血糖、口渴多飲、易饑多食為特征的代謝性疾病[1]?！吨袊? 型糖尿病防治指南2017 版》中指出，我國≥18 歲人群中2 型糖尿病發病率已達10.4%，其中男性11.1%，女性9.6%[2]。隨著我國經濟的快速發展和居民生活水平的提升，我國DM 患病率呈爆發式增長，目前患病總人數居世界首位[3]。本病的發病機制尚未完全闡明，多數學者認為其主要是由于胰島素抵抗和胰島素分泌不足引起的，現有研究發現長期睡眠不足與生理時鐘紊亂也會對提高發病率產生一定影響[4]。祖國醫學現在多將DM 歸為“消渴”范疇，“消渴”之名首次記載于《素問·奇病論》。其屬本虛標實證，與稟賦不足、飲食失節、情志失調、勞欲過度等因素有關。本病以陰虛為本, 燥熱為標，兩者互為因果，而陰虧是發生DM的關鍵。

玄參、麥冬是一對消渴病常用藥對。玄參甘苦寒而質潤，歸心、腎、肺、胃經，具有清熱涼血、養陰生津的功用?！侗静菡x》中記載道：“玄參，稟至陰之性，專主熱病……直走血分而通血瘀?！爆F代研究表明玄參有效成分有抗糖尿病作用[5]，其有效成分能降低糖尿病大鼠血糖水平與肝腎的脂質過氧化水平,增加抗氧化酶活性，同時降低糖尿病小鼠血糖、胰島素和甘油三酯的水平[6]。麥冬甘微苦寒，歸心、肺、胃經，有養胃陰、生津液之效?，F代研究表明麥冬有效成分可改善微循環，對降低血糖有較好的促進作用，同時具有增強免疫的作用[7]。

網絡藥理學可通過從系統層次和生物網絡的整體角度出發，解析藥物及治療對象、疾病之間的分子關聯規律，突破傳統理念，為中藥復方體系研究提供新思路[8]。本研究主要是運用網絡藥理學從整體角度闡釋玄參-麥冬藥對治療DM 的協同機制。

1 資料與方法

1.1 玄參、麥冬成分及對應靶點的收集

在BATMAN-TCM 數據庫(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/) 中, 分別以“麥冬”和“玄參”為關鍵詞, 設置“Score cutoff ≥20”和“P≤0.05”的標準 ，構建“藥物-靶點”的模型閾值, 并分別檢索篩選麥冬和玄參成分及符合標準的靶點。

1.2 DM 相關靶點的收集

通過Gene Card 數據庫(http://www.genecards.org/)、OMIM 數 據 庫(https://omim.org/) 檢 索DM 相關靶點, 檢索詞為“diabetes”, 并進行靶點匯總。利用VENY2.1 網 站（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）篩選疾病與中藥的共同靶點，繪制Venn 圖。

1.3 玄參、麥冬活性成分及DM 相關靶點網絡的構建

1.3.1 玄參、麥冬活性成分網絡構建 將玄參、麥冬的化合物和相關蛋白質靶點導入Cytoscape 3.7.2 軟件中，構建玄參、麥冬的藥物- 活性成分- 作用靶點網絡，使化合物和靶點的關系可視化，并使用Network Analyzer 插件對此進行拓撲分析，其中以degree 與betweenness centrality 為主要參量，得到主要活性成分和靶點。這些作用于數量較多蛋白靶點的活性分子，將會是接下來研究中密切關注的重點。

1.3.2 DM 相關蛋白相互作用網絡構建 采用在線Venn 圖選取玄參、麥冬活性成分作用靶點與DM 相關基因的交集，導入String 數據庫(http://string-db.org/)，構建DM 相關靶點網絡。同時得到交集蛋白之間的PPI 數據，導入Cytoscape 3.7.2 軟件，進行可視化分析，構建蛋白相互作用（PPI）網絡。運用插件MCODE 對 PPI 網絡進行進一步的分析，得到潛在的蛋白質功能模塊。再次運用Network Analyzer 插件進行拓撲分析，得到核心蛋白靶點。

1.4 基因功能富集分析

根據上述結果， 采用ClusterProfiler 數據庫（https://yulab-smu.github.io/clusterProfiler-book/index.html）將玄參、麥冬治療DM 的靶點基因錄入，設置P＜0.05，進行GO 生物學過程富集分析和KEGG 通路富集分析。

2 結果

2.1 玄參、麥冬藥對主要活性成分篩選

通過BATMAN-TCM 數據庫篩選得到玄參-麥冬藥對中的23 個活性成分，其中玄參的活性成分5 個，麥冬的活性成分18 個，見表1。

表1 玄參、麥冬化合物集合

2.2 玄參、麥冬治療DM 潛在靶點的預測

根據篩選標準, 通過BATMAN-TCM 數據庫檢索中藥活性成分, 并利用該平臺獲得玄參、麥冬藥對的活性成分所對應的靶點蛋白。在去除無效和重復的靶點后, 得到玄參、麥冬活性成分的靶點基因535個。通過GeneCard 數據庫平臺, 根據篩選標準, 篩選出DM 的潛在靶點1141 個。繪制Venn 圖，得到疾病和中藥成分的共同基因靶點118 個, 如ACADM、AKT1、ALDH2、AVP、DNMT1、ESR1、NOS2、TPO、SLC25A13 等。

2.3 玄參、麥冬與DM 的交集基因

通過在線Venn 圖得出麥冬、玄參與DM 的共有基因118 個，玄參與DM 的共有基因76 個，麥冬與DM 的共有基因52 個。即說明玄參- 麥冬藥對與DM的相關潛在作用靶點共有118 個交集，其中玄參76個（占玄參預測總靶點的64.4%），麥冬52 個（占麥冬預測總靶點的44.1%）。見圖1。

圖1 玄參、麥冬與DM 相關靶點交集圖

2.4 網絡可視化

2.4.1 玄參、麥冬化合物- 靶點相互作用網絡 將上述數據導入Cytoscape 3.7.2 后，構建化合物- 靶點網絡。在網絡中化合物由紅色節點（23 個）表示，靶點蛋白由藍色節點表示，一共有708 個節點，847 條邊，見圖2。以網絡節點的度值和中介中心度等拓撲學性質為標準，篩選出核心節點，見表2。其中排名靠前的是L- 天冬酰胺（L-Asparagine）、對甲氧基肉桂酸（P- MAC）等。

圖2 玄參、麥冬成分靶點圖

表2 玄參、麥冬的靶點成分-靶點網絡拓撲分析

2.4.2 玄參、麥冬PPI 網絡的構建與分析 利用STRING 構建了玄參、麥冬靶點的PPI 網絡圖，見圖3。并通過Cytoscape 3.7.2 打開，運用MCODE 插件對網絡進行分析，得到module，見圖4。對此PPI 網絡進行拓撲學分析，滿足標準的靶點蛋白即為核心靶點蛋白，見表3。排名靠前的是AKT1、LEP、NOS3、EDN1、IGF1。

表3 玄參、麥冬靶點相互作用網絡拓撲分析

圖3 玄參、麥冬-糖尿病靶點的PPI 網絡

圖4 玄參、麥冬-糖尿病靶點PPI 網絡中的module

2.5 GO 功能富集分析

為了預測玄參、麥冬治療DM 的作用機制，對其進行GO 生物過程富集分析。將105 個潛在靶點錄入ClusterProfiler 數據庫，進行生物學功能富集，系統地分析其生物過程，其中最顯著相關功能條目見圖5。玄參、麥冬主要參與的生物學過程包括脂質代謝過程的調控（regulation of lipid metabolic process）、生物對營養元素的應答過程（response to nutrient levels）、對肽激素的應答（response to peptide hormone）、小分子代謝進程（ regulation of small molecule metabolic process）、神經遞質的生物合成過程（neurotransmitter biosynthetic process），見圖5（A）。

2.6 KEGG 通路富集分析

將上述靶點錄入ClusterProfiler 數據庫，進行KEGG 通路富集分析。其中參與的主要通路有，脂肪因子信號通路（Adipocytokine signaling pathway）、2 型糖尿?。═ype II diabetes mellitus）、胰島素信號 通 路（Insulin signaling pathway）、 鈣 信 號 通 路（Calcium signaling pathway）、 癌 癥 通 路（Pathways in cancer）、丙酮酸代謝（Pyruvate metabolism）、肥厚型心肌?。℉ypertrophic cardiomyopathy , HCM）、ErbB 信號通路（ErbB signaling pathway）、1 型糖尿?。═ype I diabetes mellitus）、MAPK 信號通路（MAPK signaling pathway）等，見表4、圖5（D）。分析反映了玄參、麥冬可能通過這些信號通路發揮治療作用。

表4 玄參、麥冬潛在靶點和信號通路信息

圖5 玄參、麥冬治療DM 靶點GO 富集分析及KEGG 富集分析通路

3 討論

玄參-麥冬藥對源于《辨證錄》中的玄冬湯和《醫學集成》中的玄麥飲[9]。玄參-麥冬均甘寒，兩者相配伍使其養陰生津、清熱潤燥的功效倍增，與糖尿病陰津虧損、燥熱偏勝的病機相應?，F代藥理學研究顯示，玄參中含有環烯醚萜、苯丙素苷、有機酸、萜類、苯酚、甾醇、黃酮、糖類等化學成分，具有抗炎、調節免疫、保護神經元等藥理作用[10]。麥冬的化學成分主要包括甾體皂苷類、高異黃酮類、多糖類等有效成分，具有降血糖、增強免疫力等藥理作用[7]。玄參-麥冬藥對常出現在名老中醫經驗用藥治療糖尿病中，如施今墨老先生認為玄參偏入腎以滋養腎陰，壯水制火，清熱解毒 ；麥冬偏入肺以益胃生津，除煩止渴。玄參與麥冬相配伍，可達到金水相生，養陰生津，潤燥止渴的效果。玄參配麥冬可治療病機屬肺胃陰虛之證（治以養陰增液為法），施先生常將其用于津少口干、口渴多飲、舌紅少苔等證[11]。趙洪偉[12]的研究顯示，玄參中的玄參多糖具有良好的降血糖作用，且劑量越大，降血糖效果越好，除此之外，玄參多糖對糖代謝、脂代謝以及抗氧化能力也有一定的調節作用。張寧[13]的研究表明，玄參及其組分可通過多途徑保護胰島β 細胞，改善糖、脂代謝；其中，降血糖的物質基礎可能是苯丙素酸苷、環烯醚萜等組分。施吉祥[14]研究發現，麥冬多囊脂質體能夠有效減輕2 型糖尿病小鼠的胰島素抵抗癥狀，降低其口服糖耐量，且效果優于麥冬多糖。吳萬征[15]研究發現，麥冬寡糖可顯著降低自發性2 型糖尿病db/db 小鼠的空腹血糖水平、24 小時蛋白尿量、血清尿素氮和血清肌酐濃度，對小鼠的糖代謝和腎損傷有著正面效應。

本論文欲通過網絡藥理學探究玄參、麥冬多成分、多靶點、多通路治療糖尿病的作用機制。通過以上信息搜集、數據統計與分析，本研究共收集到治療糖尿病的活性成分118 個，與2 型糖尿病有共同作用靶點的活性成分共10 個，其中L- 天冬酰胺（L-Asparagine）、對甲氧基肉桂酸（P- MAC）是核心結點化合物，可推知是玄參、麥冬治療糖尿病的重要活性成分。研究表明，天冬酰胺受到ASPG 基因中遺傳變異的強烈影響[16]。該基因編碼天冬酰胺酶，該酶可將天冬酰胺轉化為天冬氨酸。天冬酰胺酶是一種白血病藥物，可降低血漿天冬酰胺的水平。天冬酰胺酶的不良反應包括高血糖癥和葡萄糖耐量降低[17]。因此，無論是通過ASPG 基因的正常遺傳變異還是通過添加天冬酰胺酶來增加天冬酰胺向天冬氨酸的轉化，都可能導致循環天冬酰胺水平的降低和高血糖癥的發生。這表明，低血漿天冬酰胺水平與糖尿病前期之間存在潛在的因果關系。但Filip Ottosson 發現天冬酰胺水平與空腹血糖之間沒有關聯，這意味著其與DM 的關聯可能是由葡萄糖耐量降低或其他機制驅動的[18]。P-MCA 可通過增加胰島素分泌、糖酵解，以及減少糖原異生來發揮降血糖作用[19]。

本研究中利用繪制Venn 圖，得到疾病與中藥活性成分的共同基因靶點118 個，并通過繪制PPI 靶點圖得到10 個核心靶點，分別是AKT1、IGF1、NOS3、TNF、LEP、JUN、EDN1、NOS2、IL1B、PTGS2，提示玄參- 麥冬藥對主要通過作用于這些靶點治療2 型糖尿病。Akt 可被稱為蛋白激酶B 或PKB，Akt1 ( 或稱為PKBα) 是其中一種亞型。相比于Akt 的其他亞型，Akt1 是在肝細胞中可檢測到的主要的胰島素激活的PKB 亞型[20]?，F代研究表明，Akt1 的解除調控與糖尿病的發病機制有關[21-22]。Akt 可通過刺激GLUT4葡萄糖轉運體轉運到質膜來調控葡萄糖進入肌肉和脂肪細胞，并通過抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和葡萄糖6- 磷酸酶這兩種關鍵酶的表達，在胰島素抑制肝臟糖異生過程中發揮作用[23]。IGF1 是胰島素樣生長因子1，是一個由人類基因IGF1 編碼的蛋白質。IGF-1 的動力學數據表明，大多數循環IGF-1 由肝細胞產生，主要存在于人類脂肪細胞中，和胰島素具有共同的進化起源和分子相似性[24]。研究者得出結論，IGF-1 具有與胰島素類似的代謝作用。當使用啟動(20罐/kg bolus)，恒定(24 /tg/kg / h) 滴注IGF-1 并保持正常血糖時，IGF-1 的作用類似于外源性胰島素，即通過降低c 肽水平，抑制肝臟葡萄糖生成，刺激外周葡萄糖攝取，并抑制脂肪分解和蛋白質分解代謝[25]。通過KEGG 通路富集分析可以得知脂肪因子信號通路、胰島素信號通路、MAPK 信號通路等通路可能是改善DM 的作用機制。有研究表明，來自脂肪組織的細胞因子對胰島素抵抗的發生有重要作用[26]。在生理狀態下，脂肪因子通過內分泌、旁分泌等途徑來影響胰島素的生物學效應，改善胰島素抵抗，而在病理狀態下，如肥胖、代謝綜合征等，則會導致脂肪因子的分泌和功能失調，進而加重糖代謝異常、脂代謝異常和胰島素抵抗等。瘦素是一種肽類激素，是由脂肪細胞分泌的，在肥胖人群里會產生瘦素抵抗現象，出現瘦素對胰島素的抑制作用減弱，正常的脂肪- 胰島素反饋機制被破壞，胰島素大量分泌出現高胰島素血癥[27]。近年來，有學者研究發現一種新型脂肪因子胰島素快速誘導基因（INSIG）蛋白，其可以改善胰島素抵抗以及胰島β 細胞功能。Carobbio[28]研究指出，通過對體內外小鼠脂肪細胞調節INSIG 編碼蛋白表達，可以明顯改善與胰島素抵抗相關的脂代謝紊亂，進而改善胰島素抵抗。Chen 等[29]報道，通過調節INSIG-1/SREBP-1c 途徑，可增加抗氧化物質活性，進而保護胰島β 細胞免受糖毒性損傷，從而改善胰島β 細胞功能[30]。當胰島素與胰島素受體結合時，胰島素信號通路中的蘇氨酸蛋白酶（AKT）被磷酸化的磷酸肌醇3- 激酶（PI3K）激活后，活化的AKT抑制下游分子磷酸肌醇3- 激酶（PI3K）活性，可抑制糖原合成酶磷酸化和糖原合成，進而升高血糖。正常的胰島素信號轉導可以促進糖原的合成和葡萄糖的轉運，達到降血糖的目的。MAPK 信號通路與糖尿病患者的高血糖、氧化應激、生長因子等有關。糖尿病狀態下的高糖蛋白激酶C (PKC) 通路、糖基化終產物、氧化應激、生長因子等都可激活MAPK 家族 , 使轉錄因子活性升高 , 參與糖尿病慢性并發癥的發生。阻斷MAPK 通路將可能成為治療糖尿病并發癥的新思路,而MAPK 將可能成為治療糖尿病并發癥的新靶點[31]。綜上所述，本研究通過網絡藥理學的方法對玄參、麥冬治療糖尿病的作用機制進行研究，結果表明，玄參、麥冬的核心活性成分L-天冬酰胺、對甲氧基肉桂酸中的核心靶點AKT1、IGF1 等可通過脂肪因子信號通路、胰島素信號通路、MAPK 信號通路等通路發揮治療糖尿病的作用，體現了多通路、多靶點聯合作用的特點。這為臨床使用玄參、麥冬治療糖尿病提供了科學依據。