菜心小孢子培養技術的研究進展

任海龍，周賢玉，孫藝嘉，李光光，江定，張華，戴修純，張晶，鄭巖松

（廣州市農業科學研究院， 510308）

菜心（Brassica campestrisL.ssp.chinensisvar.utilisTsen et Lee）又名菜薹，是嶺南地區栽培規模最大的特產蔬菜之一，僅廣東省每年的栽培面積就在300萬畝（20萬hm2）次以上。近年來，以寧夏為代表的菜心產業化布局快速發展，使之成為一種全國性的大宗蔬菜，在我國蔬菜生產中的地位越來越重要[1]。菜心主要通過雜交選育的方式獲得新品種，選育過程一般需6～8代，相當費工費時，且長期自交還會出現種性衰退現象[2]。整齊一致且生產性能強的雜交菜心品種是當前育種追求的主要目標。應用游離小孢子培養技術獲得單倍體，進而加倍成后代完全純合的雙單倍體植株（DH植株），可在短時間內獲得純合、穩定的育種材料，從而大幅度縮短育種年限，并且還能分離得到隱性性狀，在創制菜心優良自交系和提高育種效率方面具有明顯優勢，因而備受關注[3～10]。

1982年Robert[11]首次利用小孢子培養技術，成功獲得了甘藍型油菜的小孢子胚狀體及其再生植株。自此以后，游離小孢子培養技術進入了快速發展階段，國內外已先后將小孢子培養技術應用到油菜[12]、大白菜[13，14]和甘藍類蔬菜[15]的育種中。 我國在20世紀90年代中期才報道了菜心小孢子培養的研究[16]，相對于其他十字花科蔬菜，菜心小孢子培養的起步晚，難度大，還未有培育出品種的報道。

菜心繁種田

1 菜心小孢子培養的影響因素

1.1 基因型

基因型被認為是影響菜心游離小孢子成胚的首要因素。朱允華等[4]以特早50、青梗菜心和四九菜心（19）為供試材料，分析了影響菜心游離小孢子培養的因素，認為基因型對小孢子培養起著決定性的作用，不同材料間誘導頻率差異顯著；曾小玲等[5]以11個不同基因型的菜心栽培品種為試材，結果有7個基因型材料獲得小孢子胚，且不同基因型誘導形成胚的頻率存在顯著差異，同樣表明基因型是影響菜心小孢子胚發生的重要因素；Wong等[17]進一步研究發現，晚熟類型比早熟類型菜心小孢子的出胚率高。近年來，楊易等[8]和趙艷艷等[9]對不同基因型菜心進行了小孢子離體培養的胚胎誘導研究，結果均表明，基因型是決定菜心品種能否出胚的一個重要因素，不同基因型試材間小孢子胚誘導率具有明顯差異。

1.2 生理狀態

單核靠邊期被認為是小孢子成胚誘導的最佳時期，小孢子發育時期通常需要在顯微鏡下鏡檢確定。為了取樣方便，Wong等[17]提出花蕾在2.0～2.9 mm時的出胚率最佳；龐強強等[2]研究也發現菜心小孢子發育時期與花蕾和花藥外部形態特征密切相關，得出單核靠邊期的花蕾縱徑3.05～3.39 mm，花萼長3.25～3.46 mm，花瓣長2.10～2.33 mm，瓣萼比為0.63～0.71，花藥長2.57～2.89 mm、瓣藥比為0.77～0.85，可作為不同材料花蕾最佳取樣時期的鑒定指標，為菜心小孢子花蕾的選擇提供了依據。

另外，植株生長的環境條件也會影響小孢子胚或胚狀體的產量。曾小玲等[5]的試驗結果表明，當晝夜氣溫在12～24℃時菜心胚誘導率較高，夜溫低于10℃或日溫高于30℃時均不利于菜心游離小孢子的出胚，春季小孢子培養的脫分化能力比秋季高。

1.3 預處理

小孢子培養需要打破配子體原有的發育方向，溫度調節是主要手段。朱允華等[4]認為，4℃低溫預處理幼花穗可明顯提高小孢子胚狀體的誘導率；Cao等[16]研究認為，在小孢子培養體系中，將過濾后的菜心小孢子于33℃熱激處理1 d，對游離小孢子的膨大至關重要，不進行熱激處理或熱激處理3 d都會明顯抑制小孢子的成胚；Wong等[17]發現，32℃熱激處理48 h出胚效果更好。

1.4 培養基及其添加物

菜心小孢子培養中常用的培養基是B5培養基和NLN培養基，B5培養基用于沖洗液，NLN培養基用于胚狀體誘導。通常還會添加蔗糖、NAA、6-BA和活性炭等促進小孢子胚胎的發育。當前已發表的菜心小孢子培養基配方如表1。

表1 已發表的菜心小孢子培養基配方

蔗糖濃度為100～170 g/L的NLN培養基是進行菜心小孢子胚誘導的基礎培養基。楊易等[8]采用不同蔗糖濃度和激素配比的誘導培養基，對不同基因型菜心進行小孢子離體培養的胚胎誘導，認為不同蔗糖濃度的NLN誘導率差異顯著，NLN-10誘導效果最佳，出胚率最高，達30.46胚/皿，在NLN-10中分別添加0.1 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA，能顯著提高出胚率，是不加激素NLN-10處理出胚率的1.5倍，但該激素組合對難出胚的試驗材料無促進出胚作用，且當6-BA和NAA濃度均提高到0.2 mg/L時，胚胎生長發育受到抑制；趙艷艷等[9]以10個菜心品種為試材進行小孢子培養及體系優化，結果表明，同一基因型在不同培養基成分誘導條件下，添加活性炭對小孢子胚狀體誘導率的影響較大，培養基中蔗糖質量濃度為130 g/L時胚誘導率最高，在培養基中添加0.05 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA可以顯著提高菜心胚狀體誘導率；此外，朱允華等[4]也認為培養基中加入活性炭可改善胚的分化；與固定的蔗糖濃度NLN培養基不同，曾小玲等[5]提出熱激培養第1天用170 g/L高濃度蔗糖培養之后轉換成含130 g/L蔗糖培養基能顯著提高小孢子胚誘導率，同時添加0.05 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA能促進菜心小孢子誘導成胚，添加0.4 mg/L GA3可顯著提高菜心小孢子胚芽誘導率和平均每胚出芽數；顧宏輝等[3]在前人研究的基礎上，以早熟菜心品種油青四九為供體材料，認為熱激誘導后更換培養液比不換培養液連續培養能明顯改善胚狀體質量，提高正常胚狀體比例；近年，牛劉靜等[6，7]在大白菜培養體系的基礎上建立了增城菜心和連州菜心的小孢子培養體系，并探討了細胞器抗氧化劑（VcNa）和植物生長調節劑（BR和TDZ）對小孢子胚胎發生及胚狀體再生成苗的影響，認為在NLN-13培養基中添加適宜濃度的BR或TDZ可顯著提高連州菜心小孢子胚胎發生率和直接成苗率，擴展了原有小孢子添加物的種類。

2 菜心染色體加倍與植株再生

染色體加倍是培育菜心雙單倍體植株的關鍵。顧宏輝等[3]的研究表明，游離小孢子培養的菜心具有較高比例的自發二倍體（70%）及四倍體（8%），較少的混倍體，這與甘藍型油菜再生植株的倍性分布相反，可以省去加倍等繁瑣步驟，能直接應用于育種研究中。龐強強等[10]對3份不同基因型的菜心研究發現，再生植株的二倍體自然加倍率在62.22%～71.11%，75 mg/L秋水仙素處理可以提高再生株系的二倍體率。

3 存在問題與發展方向

雖然菜心的小孢子培養已經取得了一定的進展，但是目前菜心尚未形成統一的小孢子培養體系，且出胚率和植株成苗率仍然不是很高，體系的重復性和穩定性都不好，致使還未能在育種中應用。如新近發表的文章中，趙艷艷等[9]認為，130 g/L蔗糖濃度NLN（NLN-13）小孢子胚誘導率最高，在培養基中添加0.05 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA可以顯著提高菜心胚狀體誘導率；而楊易等[8]則認為，100 g/L蔗糖濃度NLN（NLN-10）小孢子胚誘導率最高，130 g/L蔗糖濃度NLN（NLN-13）會明顯降低菜心的出胚率，分別添加0.1 mg/L 6-BA和NAA的出胚效果最佳。所報道的菜心小孢子培養體系大相徑庭，建議今后應從以下3個方面著手開展工作。

菜心小孢子胚狀體和幼苗

①對已報道的菜心小孢子體系進行優化，找到一種適合各菜心基因型的普適型培養體系，使小孢子培養技術得到更廣泛的應用。

②在此基礎上，進一步簡化和完善菜心小孢子培養體系中預處理方式、培養基成分及外源添加物等方案，大幅提高小孢子的出胚率。

③開展菜心小孢子胚胎發育過程和發育途徑的基礎研究，為完善菜心單倍體育種技術提供理論基礎和依據。