TIGIT與CD155在三陰性乳腺癌組織中的表達及其臨床意義

張燕，鄭梓瑩，陳文，楊鈺斌，黃種心（福建醫科大學附屬第二醫院.中西醫結合腫瘤科；.病理科，福建泉州 362000）

三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）占所有乳腺癌的比例為10%～20%，具有侵襲性強、早期復發風險高等特點[1]。目前其治療仍以化療為主，盡管已有抗PD-1/PD-L1單抗藥物被批準用于治療轉移性或不可切除局晚期TNBC[2-3]，但實際獲益人群非常有限，多數TNBC患者仍臨床預后差，晚期TNBC患者中位OS約12個月，4年生存率低于20%[1]。故尋找新的預后生物標志物及治療靶點成為臨床亟待解決的問題。T 細胞免疫球蛋白和ITIM 結構域蛋白（T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domain，TIGIT）是共抑制性免疫受體，其被激活后會抑制免疫細胞活化、增殖并誘導免疫抑制性因子的產生[4-5]。CD155是TIGIT的高親和力同源配體，在細胞黏附和增殖中起重要作用，其在多種腫瘤中過表達，促進腫瘤增殖、侵襲，導致預后不良[6-9]。TIGIT 與其配體CD155結合后，通過胞內的ITIM結構域傳遞抑制信號，抑制T細胞和NK 細胞的抗腫瘤反應，導致腫瘤細胞發生免疫逃逸[10]。因此，TIGIT/CD155有望成為腫瘤免疫治療的新靶點或預測預后的標志物。本研究檢測TNBC組織中TIGIT和CD155蛋白的表達并分析其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2014 年1 月至2018 年12 月福建醫科大學附屬第二醫院通過手術切除、術后病理確診為TNBC的64例女性患者的腫瘤組織。通過醫院病歷系統收集入組患者的臨床病理資料，通過住院、門診及電話隨訪等方式隨訪其生存預后情況。本研究通過福建醫科大學附屬第二醫院倫理委員會審批，倫理審批號：[2022]福醫附二倫理審字（12）號。

納入標準：（1）2014年1月至2018年12月，通過手術切除、術后病理確診為TNBC的女性患者；（2）確診前未經過放化療、內分泌治療等腫瘤?？浦委?；（3）病理蠟塊保存完好，病例資料完整可隨訪；（4）患者依從性好，能夠配合研究；（5）患者及家屬知情同意。

排除標準：（1）不符合診斷或入選標準；（2）患有不易控制的神經、精神疾病或認知障礙、精神障礙；（3）因自身原因無法完成隨訪及調查；（4）其他原因不適合入組。

1.2 免疫組化染色法檢測TIGIT在TNBC組織中的表達

組織切片脫蠟、水化，PBS沖洗3次，高溫抗原修復，PBS 洗3 次，3%過氧化氫封閉內源性過氧化物酶，PBS 洗3 次，加入一抗（抗TIGIT 單 抗，購 自Abcam 公司，貨號ab243903，稀釋度1∶100；CD155，購自Abcam 公司，貨號ab267389，稀釋度1∶100）室溫下孵育1 h，PBS 洗3 次，滴入增強液，室溫下反應20 min，PBS洗3次，加入二抗，室溫下反應20 min，PBS洗3次，加入辣根過氧化物酶DAB顯色。

1.3 免疫組化染色結果判讀

每個組織切片隨機選取5個高倍視野觀察，綜合切片的陽性細胞比例及染色強度計分，行半定量分析[11]。染色強度分為0～3 分：0 分為無染色，1 分為弱染色，2 分為中等染色，3 分為強染色；陽性細胞占細胞數百分比的評分分為0～3 分：陽性細胞率（以整數制計算）≤5%的為0 分，6%～25%為1 分，26%～50%為2 分，≥51%為3 分。以上兩者積分相乘得總分，總分0分為陰性染色，1～2分為弱陽性（+），3～4分為陽性（?），6～9分為強陽性（?）。

1.4 統計學處理

采用SPSS 25.0軟件處理數據。TIGIT、CD155與臨床病理參數之間的關系采用χ2檢驗或Fisher's精確檢驗統計進行分析；生存分析單因素采用Kaplan-Meier生存曲線和Log-Rank檢驗進行分析，多因素生存分析采用Cox回歸分析法檢驗。所有的檢驗采用雙側檢驗法，以P＜0.05或P＜0.01表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 TNBC患者臨床病理特征

本研究總計入組64例患者，所有病例的臨床病理資料完整，入組患者年齡32～78歲，中位年齡49.5歲；絕經前34例、絕經后30例；腫瘤長徑≤2 cm者23例，腫瘤長徑＞2 cm者41例；基于美國癌癥聯合委員會（AJCC）腫瘤分期手冊第八版的TNM分期標準判定腫瘤組織的TNM分期，64例患者中，Ⅰ期15例、Ⅱ期27例、Ⅲ期22例；按照Elston和Ellis標準進行組織學分級：組織學分級Ⅱ級17例、組織學分級Ⅲ級47例；淋巴結轉移31例。通過門診、住院復查及電話隨訪方式獲得患者的無病生存期（disease-free survival，DFS），隨訪截止時間：2021年12月31日?；颊咴敿氋Y料見表1。

表1 64例患者的臨床病理資料(n=64)

2.2 TNBC中TIGIT表達與臨床病理參數的相關性

免疫組化染色結果（圖1）顯示，TIGIT 主要定位于TNBC 實質細胞的細胞膜，64 例TNBC 組織中，TIGIT陽性表達率為48.4%（31/64）。TIGIT表達與腫瘤大?。≒＜0.05）、淋巴結轉移（P＜0.01）、腫瘤分期（P＜0.01）有關（表2），而與年齡、絕經狀態、組織學分級、Ki-67均無關（均P＞0.05，表2）。

圖1 TNBC組織中TIGIT表達（免疫組化染色，×200，標尺：100 μm）

2.3 TNBC中CD155表達與臨床病理參數的相關性

免疫組化染色結果（圖2）顯示，CD155主要表達于TNBC實質細胞的細胞膜及細胞質，64例TNBC組織中，CD155 陽性表達率為79.9%（51/64）。CD155表達與腫瘤大?。≒＜0.05）、淋巴結轉移（P＜0.01）、腫瘤分期（P＜0.01）相關，與年齡、絕經狀態、組織學分級、Ki-67無關（均P＞0.05，表2）。

圖2 CD155在TNBC組織中的表達（免疫組化染色，×200，標尺：100 μm）

表2 TIGIT和CD155表達與臨床病理參數的相關性

2.4 TIGIT、CD155表達與患者DFS的關系

采用Kaplan-Meier 生存曲線和Log-Rank 檢驗分析TIGIT（圖3A）、CD155（圖3B）表達與TNBC 患者DFS 的關系，結果顯示，TIGIT 陰性患者平均DFS 為41.627 個月（95%CI：35.920～47.333），TIGIT 陽性患者的平 均DFS 為20.400 個 月（95%CI：15.289～25.511），TIGIT 陽性患者DFS 低于TIGIT 陰性患者（χ2=18.128，P＜0.01）。

圖3 TIGIT（A）、CD155（B）表達水平與TNBC患者DFS的關系（生存曲線圖）

生存分析顯示，CD155 陰性患者平均DFS 為48.962 月（95%CI：39.215～58.708），CD155 陽性患者的平均DFS 為27.241 月（95%CI：22.484～31.999），差異具有統計學意義（χ2=12.045，P＜0.01），表明CD155陽性患者DFS低于CD155陰性患者。

2.5 影響TNBC患者DFS的單因素及多因素分析

采用Cox 回歸對TNBC 患者DFS 進行單因素和多因素分析。單因素分析發現，入組患者的DFS 與腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM 分期及腫瘤TIGIT 和CD155 的表達相關（均P＜0.01，表3）。將以上5 項具有統計學意義的指標納入Cox 多因素分析，結果顯示：僅腫瘤TNM 分期為TNBC 患者的獨立預后危險因素（HR=4.751，95%CI:1.982～11.388，P＜0.01）。

表3 影響TNBC患者預后的單因素和多因素分析

3 討論

TIGIT是Ⅰ型穿膜蛋白，由一個胞外免疫球蛋白可變區、一個Ⅰ型穿膜區和一個短胞內區組成，其中含有一個ITIM和一個ITT樣基序[12]。目前TIGIT對免疫細胞的調節包括胞內和胞外機制[13-14]。TIGIT對NK細胞有直接抑制作用，主要表現在TIGIT可以降低NK細胞分泌IFN-γ的能力并抑制CD226的激活和NK細胞毒性作用[12]。TIGIT與CD226競爭性結合CD155，一方面抑制CD226的激活，導致CD226發生去磷酸化來抑制T細胞的抗腫瘤免疫反應[15]。另一方面，ITT基序被磷酸化并與生長因子受體結合蛋白2（growth factor receptorbound protein 2，Grb2）結合，隨后招募含SH2結構域的肌醇磷酸酶-1（SHIP-1）到TIGIT的細胞質尾部，抑制PI3K、MAPK和NF-κB信號通路，繼而導致NK細胞毒性減弱和細胞因子分泌減少[16-17]。TIGIT對T細胞也有直接抑制作用，在效應性T細胞中，TIGIT可直接抑制T細胞的活化和增殖，從而限制效應性T細胞的功能，減少細胞因子的產生，發揮抑制作用。在胞外，TIGIT與DC表面的CD155相互作用會間接抑制T細胞免疫反應。TIGIT與CD155結合誘導產生耐受性DC，其抗原提呈功能受到抑制、共刺激分子表達減少、免疫抑制因子IL-10分泌增多、促炎細胞因子IL-12的產生減少，從而抑制T細胞的激活、增殖與活化[18]。TIGIT還通過增強和調節Treg細胞的抑制功能來間接抑制免疫反應。TIGIT+Treg細胞可上調多個Treg細胞標志物的表達,包括FOXP3、IKZF2、CTLA-4、PD-1和LAG-3。TIGIT+Treg細胞也能抑制促炎性Th1和Th17型免疫反應的能力，但不能抑制Th2型免疫反應，因此TIGIT+Treg有效抑制了效應性T細胞的激活和增殖[19-20]。

研究證實，TIGIT表達上調與多種腫瘤的不良臨床結局有關，包括肝癌[7]、黑色素瘤[21]、急性髓細胞白血病[22]、子宮內膜癌[23]、結直腸癌[24]。王偉杰等[24]研究發現，結直腸癌組織中TIGIT的陽性表達率顯著高于癌旁組織，其表達與腫瘤分化程度、病理分期及淋巴結轉移具有相關性；DUAN[7]等在肝細胞癌中的研究發現，癌組織中TIGIT表達水平隨著腫瘤分化程度由高到低逐漸上調，且與AFP 水平呈現正相關?；赥IGIT在抗腫瘤免疫中的重要作用，已有多項臨床前及臨床研究證實靶向TIGIT 免疫治療的有效性[14]。Ⅱ期臨床研究CITYSCAPE 的結果[25]證實，新型抗TIGIT抗體 tiragolumab聯合PD-L1 抑制劑atezolizumab 對比安慰劑聯合atezolizumab 顯著提高PD-L1 陽性NSCLC 患者的ORR 和PFS，而不良反應并未加重。晚期實體腫瘤患者的Ⅰ期研究（NCT02964013）評估了劑量遞增的抗TIGIT 抗體vibostolimab 單一療法或聯合PD-1 抑制劑pembrolizumab 的安全性和有效性，結果發現，接受vibostolimab 聯合pembrolizumab 治療的人群ORR 為26%、疾病控制率達到51%，顯示出良好的耐受性和抗腫瘤活性[26]。此外，多個人源性抗TIGIT單抗正在進行單一療法或聯合抗PD-1/PD-L1/CTLA-4/LAG-3抗體免疫治療的臨床研究，涉及肺癌、多發性骨髓瘤、食管癌、黑色素瘤等多個瘤種，提示抗TIGIT在抗腫瘤治療中的廣闊前景[5]。

近年來關于CD155 與腫瘤的研究越來越多。CD155 可通過ITIM 結構域募集蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2 以啟動信號轉導、細胞黏附、運動、增殖和存活，對腫瘤的發生、發展起著至關重要的作用。CD155 也參與腫瘤免疫反應，其在腫瘤細胞上表達并與腫瘤浸潤淋巴細胞上的CD96、CD226 和TIGIT相互作用，在腫瘤細胞免疫監視、免疫逃逸以及調節免疫細胞殺傷腫瘤細胞等諸多方面中扮演著重要角色[10]。CD155 與TIGIT 的結合能力最高，與CD96 的結合能力次之，與CD226 的結合能力最低。研究[6-9]表明，CD155 在多種人類惡性腫瘤中表達上調并與腫瘤的侵襲和遷移能力有關。目前關于乳腺癌中CD155 表達的報道較少。既有研究[27-29]顯示，乳腺癌患者（所有亞型）的CD155 表達率從38.1%到52.3%不等，CD155 陽性表達患者可能顯示出以下特征：Ki-67 顯著升高、TIL 豐富、腫瘤分期晚、伴隨淋巴結轉移及存在浸潤性NK 細胞和巨噬細胞。CD155 表達對乳腺癌預后的影響尚未明確，研究[27,29]發現，CD155 過表達患者具有較差的OS，另一項研究[28]則認為乳腺癌胞膜CD155 高表達和NK-TIL 預示著較好的預后。YOSHIKAWA 等[30]則認為CD155 表達與生存預后無相關性。

腫瘤免疫治療是繼手術、放療、化療之后的重要治療方法。靶向CTLA-4、PD-1、PD-L1 的單克隆抗體在多種惡性腫瘤中顯示出良好的治療效果。盡管TNBC對免疫治療的反應率高于其他亞型，但總體有效率仍較低，未經選擇的TNBC患者單藥免疫治療有效率僅5%，PD-L1 陽性患者約為23%[3]，仍有相當多患者無法從目前免疫治療中受益，故探索新的免疫檢查點及潛在治療靶點對于臨床十分必要。本研究發現，新型免疫檢查點分子TIGIT和CD155在TNBC組織中高表達，且兩者表達均與腫瘤大小、淋巴結轉移、腫瘤分期顯著相關。生存分析顯示兩者表達均與較差的DFS 相關，提示TIGIT/CD155 在TNBC 微環境中發揮免疫抑制作用，可能成為TNBC治療的新靶點。TIGIT/CD155對TNBC的免疫抑制機制如何，TIGIT 表達與PD-L1 表達是否具有相關性，抗TIGIT抑制劑聯合抗PD-L1 抑制劑能否在TNBC 中發揮協同抗腫瘤作用，均需要更多研究進一步明確。