miR-124通過調節Jagged1/Notch信號通路影響腎細胞癌OS-RC-2細胞的惡性生物學行為

張煒，胡志，付橋，孫偉，徐律，褚浩，王瀟，張志超（武漢市第三醫院 泌尿外科，湖北 武漢 430074）

腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC）是腎原發腫瘤的主要類型[1]，在泌尿系統腫瘤中其發病率較高[2]。由于放化療效果不理想，手術切除是RCC的主要治療方法，但其術后復發率高達20%～40%[3]。因此，全面了解腫瘤進展的潛在分子機制有助于尋找RCC診斷和治療的新模式。微小RNA（microRNA，miRNA）及其靶基因在細胞發育、增殖、凋亡、遷移和侵襲等許多生物學過程中發揮著重要作用。其中miR-124在肝癌[4]和RCC[5]等多種癌癥細胞中均表達下調。在RCC 中，miR-124的低表達與RCC 的組織學分級、臨床分期及淋巴結轉移有關[6]。此外，miR-124也被證實能夠通過靶向HDAC4 抑制RCC 細胞的自噬而增強順鉑敏感性[7]。Jagged1（JAG1）作為Notch配體，廣泛表達于哺乳動物的多個組織和發育階段，可間接激活Notch信號通路。JAG1/Notch通路可激活多種致癌因子，調節多種細胞功能[8]。本課題組利用生物信息學軟件預測miR-124與JAG1之間可能存在靶向關系，由此推測miR-124對RCC的抑制作用可能與JAG1有關。為此，本研究通過上調miR-124 表達，觀察其對RCC 惡性生物學行為的影響，并進一步探討其與JAG1/Notch通路的調控關系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2018 年6 月至2021 年10 月在武漢市第三醫院行根治性手術治療的38 例RCC 患者的RCC 組織和癌旁組織（距離腫瘤邊緣4 cm處取材）標本。手術切除后，樣本立即被冷凍在液氮中，并在-80℃保存以供分析。所有組織標本均用福爾馬林固定，石蠟包埋。納入標準：（1）所有患者在手術前均未接受過任何形式的輔助治療；（2）經2017第8版國際抗癌聯盟標準診斷為RCC；（3）簽署知情同意書。排除標準：術前曾接受放療、化療、免疫治療的患者。

38例患者根據2005國際泌尿病理協會的診斷標準劃分：1級11例、2級13例、3級8例、4級6例。本研究獲武漢市第三醫院倫理委員會批準（批號：2018-0419）。

1.2 細胞與試劑及儀器

RCC 細胞（Caki-2、A498、ACHN、786-O、OS-RC-2）和人正常腎細胞（293T）均購自北納生物公司。RPMI 1640培養基、胎牛血清購自武漢尚恩生物技術有限公司，青霉素-鏈霉素購自上海源葉生物科技有限公司，miR-124 mimic、NC mimic、miR-124 inhibitor、NC inhibitor、pcDNA 和pc-JAG1 均購自上海GenePharma 有限公司，Lipofectamine 2000 試劑盒購自北京諾為生物技術有限公司，TRIzol、SYBR Green ⅠPCR Master Mix 購自北京優尼康生物科技有限公司，miRNeasy Mini Kit 購自杭州沃森生物技術有限公司，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒、MTT試劑盒均購自北京百奧萊博科技有限公司，兔源一抗JAG1、cleaved caspase-3、BAX、Bcl2、NICD、HES1、HES5、GAPDH 單抗及辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG二抗均購自美國Abcam公司。Nanodrop 2000微量紫外分光光度計購自深圳市瑞盛科技有限公司，ABI PRISM 7500 real-time PCR System 購自上海智巖科學儀器有限公司，Bio-rad Gel Dol EZ 成像儀購自上海艾研生物科技有限公司儀器部；多功能酶標儀購自珀金埃爾默企業管理（上海）有限公司，Transwell 小室購自上海未熹生物科技有限公司，Annexin Ⅴ凋亡檢測試劑盒購自上海生工生物公司，流式細胞儀購自碧迪醫療器械（上海）有限公司。

1.3 免疫組化法檢測JAG1在RCC組織中的表達

免疫組化采用標準技術進行。4 μm石蠟包埋組織切片在二甲苯中脫蠟，在分級醇中再水化。室溫下加入3%過氧化氫反應5 min，內源性過氧化物酶被阻斷。蒸餾水沖洗后，將組織切片放入10 mmol/L檸檬酸緩沖液（pH=6.0）中煮沸10 min，完成抗原回收。用5%～10%正常山羊血清反應30 min，進行非特異性蛋白結合。這些治療與PBS沖洗交替進行。用JAG1多克隆抗體（1∶500）在室溫下處理1 h后用PBS漂洗5 min，重復3 次，加入辣根過氧化物酶偶聯二抗（1∶1 000）反應10 min，再用PBS 漂洗5 min，重復3次，用3,3-二氨基聯苯胺染色，用蘇木精復染，然后進行透明和封片處理。最后在顯微鏡下觀察JAG1的表達情況。陰性對照是用非免疫血清替代一抗進行的。對照切片與樣品平行處理。

所有染色切片均由3 位獨立調查者以盲法進行評估。評分標準[9]：染色程度：無染色（0 分）、淺黃色（1分）、棕黃色（2分）、棕褐黃色（3分）；陽性細胞百分數：≤5%（0分）、＞5%～25%（1 分），＞25%～50%（2分），＞50%～75%（3分），＞75%（4分）。兩者得分乘積為最終評分標準，≤3分為陰性，＞3分為陽性。

1.4 細胞培養和分組轉染

將RCC 細胞（Caki-2、A498、ACHN、786-O、OSRC-2）和人正常腎細胞（293T）置于含有10%胎牛血清和青霉素-鏈霉素的RPMI 1640 培養基中，并在37 ℃、5%CO2的加濕培養箱中培養。OS-RC-2 細胞匯合度達90%左右時，根據Lipofectamine 2000 試劑盒說明書進行轉染：首先取0.8 μg 質粒DNA（NC mimic、miR-124 mimic、pcDNA、pc-JAG1）和2 μL Lipofectamine 2000 分別用50μL Opti-MEM 稀釋，混合后靜置20 min，將轉染復合物置于24孔細胞板中，100μL/孔，與細胞混合均勻后培養48 h。實驗分成5組：Control組（常規培養，不轉染）、NC mimic組（轉染NC mimic與Lipofectamine 2000復合物）、miR-124 mimic 組（轉染miR-124 mimic 與Lipofectamine 2000復合物）、miR-124 mimic+pcDNA 組（共轉染miR-124 mimic 和pcDNA 與Lipofectamine 2000 復合物）和miR-124 mimic+pc-JAG1 組（共轉染miR-124 mimic和pc-JAG1 與Lipofectamine 2000 復合物）。qPCR 法檢測轉染后的干擾/過表達效果。

1.5 qPCR 法檢測miR-124 和JAG1 mRNA 在RCC組織和細胞中的表達

采用TRIzol 根據miRNeasy Mini Kit 說明書從RCC 組織和細胞中提取總RNA。RNA 純度和濃度用Nanodrop 2000 測定，隨后RNA 在-80℃保存。將RNA 反轉錄成cDNA。以cDNA 為模板制備PCR 反應體系：cDNA 5 μL，SYBR Green ⅠPCR Master Mix 10 μL，正反向引物各0.4 μL，H2O 4.2 μL。PCR反應采用ABI PRISM 7500 real-time PCR System，具體的反應過程為95 ℃5 min、95 ℃20 s、59 ℃15 s，共39 個循環。采用U6/GAPDH 作為內參。miR-124和JAG1 mRNA 的相對表達量計算公式為2-ΔΔCt。所用引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列

1.6 雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-124 和JAG1基因間的靶向關系

采用在線生物信息學預測軟件TargetScan檢測miR-124和JAG1的結合位點。以psiCHECK2載體為基礎，psiCHECK載體圖譜如圖1所示。構建野生型（WTJAG1 3'UTR）和突變型（MUT-JAG1 3'UTR）載體質粒。根據Lipofectamine 2000 試劑盒的說明制備轉染混合物（0.8μg質粒DNA（NC mimic、miR-124 mimic、WTJAG1 3'UTR、MUT-JAG1 3'UTR）和2μL Lipofectamine 2000分別用50μL Opti-MEM稀釋后均勻混合即可得到轉染混合物），并采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測37 ℃培養24 h后的熒光素酶活性。共轉染組為NC mimic+WT-JAG1 3'UTR 組、miR-124 mimic+WTJAG1 3'UTR組、NC mimic+MUT-JAG1 3'UTR組、miR-124 mimic+MUT-JAG1 3'UTR組。

圖1 psiCHECK2載體結構圖

1.7 WB法檢測RCC組織和細胞中相關蛋白質的表達

提取組織和細胞的總蛋白，并根據BCA試劑盒的說明測定蛋白濃度。將提取的蛋白加入樣品緩沖液（30 g/孔）中，95 ℃加熱10 min。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白分離。用5%牛血清白蛋白在室溫下封閉聚偏氟乙烯膜1 h。以4倍的比例加入一抗（1∶1 000）過夜（4 ℃）：JAG1、cleaved caspase-3、BAX、Bcl2、NICD、HES1、HES5和GAPDH。然后將辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG二抗（1∶2 000）加入樣品，室溫反應1 h，用化學發光試劑處理樣品，以GAPDH 作為內參對照。經Bio-rad Gel Dol EZ成像儀掃描記錄。利用ImageJ軟件對目標條帶進行灰度值分析。

1.8 MTT 實驗檢 測miR-124 和JAG1 過表達對OS-RC-2細胞增殖的影響

轉染后的OS-RC-2 細胞接種在96 孔板上，稀釋到設計濃度（5×103個細胞/孔）。細胞在37 ℃、5%CO2培養箱中培養24、48和72 h。每孔加入20 μL的MTT（濃度5 mg/mL），繼續培養4 h。然后小心取出孔內的培養液，各加入150μL二甲基亞砜，在搖床上緩慢震蕩10 min，待結晶全部溶解后，使用多功能酶標儀在450 nm 波長下測量相應的光密度（D）值。根據公式計算RCC細胞活力：細胞活力=實驗組D值/對照組D值×100%。

1.9 Transwell 實驗檢測miR-124 和JAG1 過表達對OS-RC-2細胞遷移的影響

遷移實驗：將轉染后的OS-RC-2 細胞放置在Transwell 的上腔室，下腔室則添加含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養基，37 ℃培養48 h 后，取出上室，去除未遷移細胞，用70%甲醛固定穿膜細胞30 min，用0.1%結晶紫染色穿膜細胞。倒置顯微鏡下捕捉遷移細胞的圖像，隨機選取5個區域計數遷移細胞。侵襲實驗：操作步驟與遷移實驗基本一致，只是上腔室需要預先鋪滿50 mg/L人工基膜1∶8稀釋液。

1.10 流式細胞術檢測miR-124 和JAG1 過表達對OS-RC-2細胞凋亡的影響

用胰蛋白酶消化細胞并離心（400×g）5 min，轉染24 h后收集細胞，制成單細胞懸液（1×106/mL）。室溫下，將100 μL細胞懸液注入試管中，同時將碘化丙啶與RNaseA混合，后與細胞在4 ℃下反應30 min。立即采用流式細胞儀進行檢測和分析，使用Cell Quest 軟件進行數據分析。

1.11 統計學處理

2 結果

2.1 RCC組織中miR-124呈低表達、JAG1呈高水平

qPCR、WB法檢測結果顯示，RCC組織中miR-124水平明顯低于癌旁組織，JAG1 mRNA和蛋白水平則明顯高于癌旁組織（均P＜0.01，圖2）；RCC細胞系（Caki-2、A498、ACHN、786-O、OS-RC-2）中miR-124水平明顯比人正常腎細胞293T低，JAG1 mRNA和蛋白水平明顯比人正常腎細胞293T高（均P＜0.05），且OS-RC-2細胞中miR-124水平最低，JAG1 mRNA 和蛋白水平最高（均P＜0.05，圖3），因此選擇OS-RC-2細胞進行轉染實驗。免疫組化檢測結果（圖4）顯示，JAG1染色主要存在于細胞膜和/或細胞質中。JAG1 在RCC 組織中的陽性表達率為92.11%（35/38），陰性表達率為7.89%（3/38）；在癌旁組織中的陽性表達率為28.95%（11/38），陰性表達率為71.05%（27/38），差異有統計學意義（χ2=31.722，P＜0.05）。免疫組化評分結果顯示，癌旁組織JAG1蛋白陽性表達評分明顯低于RCC 組織[（2.56±0.24）vs（5.89±0.36）分，t=23.089，P＜0.05]。

圖2 miR-124和JAG1蛋白在RCC組織中分別呈低表達和高表達

圖3 miR-124和JAG1蛋白在RCC細胞中分別呈低表達和高表達

圖4 JAG1在RCC組織和癌旁組織中的表達（×400）

2.2 miR-124直接負調控JAG1

TargetScan 預測軟件結果（圖5A）顯示，miR-124與JAG1 3'UTR 存在作用位點。雙熒光素酶報告基因實驗檢測結果（圖5B）顯示，與NC mimic+WTJAG1 3'UTR組相比，miR-124 mimic+WT-JAG1 3'UTR組熒光素酶活性被顯著抑制（P＜0.05），而miR-124 mimic+MUT-JAG1 3'UTR 組熒光素酶活性抑制不明顯（P＞0.05）。qPCR、WB 法檢測結果（圖6）顯示，miR-124 mimic 組JAG1 mRNA 和蛋白表達顯著低于NC mimic 組，miR-124 inhibitor 組JAG1 mRNA和蛋白表達顯著高于NC inhibitor組（均P＜0.05）。

圖5 雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-124負調控JAG1

圖6 miR-124抑制OS-RC-2細胞中JAG1 mRNA（A）和蛋白（B）的表達

2.3 miR-124抑制OS-RC-2細胞增殖

qPCR、WB 法檢測結果（圖7）顯示，與Control 組和NC mimic組比較，miR-124 mimic組OS-RC-2細胞中miR-124 表達升高，JAG1 mRNA 和蛋白表達降低（均P＜0.05）；與miR-124 mimic+pcDNA組和miR-124 mimic 組相比，miR-124 mimic+pc-JAG1 組OS-RC-2細胞中miR-124 表達降低，JAG1 mRNA 和蛋白表達升高（均P＜0.05）。

圖7 共轉染miR-124 mimic和pc-JAG1抑制OS-RC-2細胞中miR-124的表達（A）促進JAG1表達（B）

MTT 法檢測結果（圖8）顯示，miR-124 mimic 組OS-RC-2 細胞活力（24、48、72 h）顯著低于Control 組和NC mimic組，miR-124 mimic+pc-JAG1 組OS-RC-2細胞活力（24、48、72 h）顯著高于miR-124 mimic+pcDNA組和miR-124 mimic組（均P＜0.05）。

圖8 共轉染miR-124 mimic和pc-JAG1提高OS-RC-2細胞的活力

2.4 miR-124 抑制OS-RC-2 細胞遷移和侵襲而促進凋亡

Transwell 實驗檢測結果（圖9）顯示，較Control組和NC mimic 組而言，miR-124 mimic 組遷移、侵襲細胞數目顯著減少，凋亡率顯著升高，cleaved caspase-3 和BAX 蛋白表達明顯增加，Bcl2 蛋白表達明顯減少（均P＜0.05）；相比miR-124 mimic+pcDNA組和miR-124 mimic 組，miR-124 mimic+pc-JAG1 組遷移、侵襲細胞數目明顯增多，凋亡率明顯降低，cleaved caspase-3和BAX蛋白表達顯著降低，Bcl2蛋白表達顯著增加（均P＜0.05）。

圖9 共轉染miR-124 mimic和pc-JAG1促進OS-RC-2細胞遷移和侵襲并抑制其凋亡

2.5 miR-124 抑制OS-RC-2 細胞中Notch 信號通路相關蛋白表達

WB 檢測結果（圖10）顯示，miR-124 mimic 組OS-RC-2細胞中NICD、HES1、HES5蛋白表達顯著低于Control 組（均P＜0.05），miR-124 mimic+pc-JAG1組OS-RC-2 細胞中NICD、HES1、HES5 蛋白表達顯著高于miR-124 mimic組（P＜0.05），而NC mimic組和Control 組、miR-124 mimic+pcDNA 組 和miR-124 mimic 組OS-RC-2 細胞中NICD、HES1、HES5 蛋白表達無明顯差異（P＞0.05）。

圖10 共轉染miR-124 mimic 和pc-JAG1 促進OS-RC-2 細胞中Notch信號通路相關蛋白的表達

3 討論

男性、年齡增長、吸煙和遺傳易感性均是目前公認的RCC危險因素。由于缺乏診斷生物標志物和早期特殊癥狀，約20%～30%的RCC患者在初始診斷時就有轉移[10]。而且，經手術治療后，RCC 患者發生轉移或復發的概率仍然較高，約為50%，這與預后不良有關[11]。因此，了解RCC 復發和轉移的分子機制對改善RCC治療意義重大。

近年來研究發現miRNA 在RCC 的生物學過程中發揮重要作用。miR-124 是一種腫瘤抑制因子，SHEN 等[12]指出miR-124 在黑色素瘤組織中表達降低，過表達miR-124 可通過降解RACK1 抑制黑色素瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，促進黑色素瘤細胞凋亡；FAN 等[13]的研究結果表明，miR-124 可通過抑制IQGAP1 的表達抑制結直腸癌的進展；在食管癌中，miR-124可抑制細胞侵襲和遷移，其抑制作用與靶向調控BECN1有關[14]；而在RCC中，miR-124過表達可抑制MMP-9表達，降低RCC 細胞的侵襲能力[15]。本研究結果顯示，miR-124 在RCC 組織和細胞中呈低表達，與?AYKARA等[16]的研究結果一致，說明miR-124在RCC 中發揮抑癌作用。由于miR-124 在OS-RC-2細胞的表達與人正常腎細胞293T 差異最大，所以本研究選擇OS-RC-2細胞中進行后續實驗。

本研究通過在OS-RC-2 細胞中轉染miR-124 mimic發現，miR-124表達顯著升高，說明細胞轉染成功；此外，過表達miR-124 可有效抑制RCC 細胞增殖、遷移和侵襲，促進RCC 細胞凋亡。Cleaved caspase-3 是caspase-3 的激活形式，細胞中cleaved caspase-3表達水平與凋亡率呈正比。BAX和Bcl2屬于同一個家族，且均與細胞凋亡有關，但兩者作用相反，BAX促進細胞凋亡，而Bcl2抑制細胞凋亡[17]。本研究結果顯示，轉染miR-124 mimic 可顯著升高cleaved caspase-3和BAX蛋白表達、降低Bcl2蛋白表達，這與凋亡檢測結果相對應，揭示miR-124 對RCC細胞凋亡的促進作用與cleaved caspase-3、BAX、Bcl2蛋白的表達水平有關。

JAG1 是Notch 典型的配體之一，已有研究證實JAG1 在肝癌[18]、乳腺癌[19]等不同類型的腫瘤中發揮促癌作用。本研究發現，JAG1在RCC組織和細胞中的表達顯著升高，這與吳科榮等[20]的研究結果一致，提示JAG1 在RCC 中也作為促癌因子起作用。PAN等[21]指出，miR-124 通過靶向JAG1 抑制胃癌進展。而本研究通過TargetScan 預測軟件得到miR-124 與JAG1 3'UTR 互補的核苷酸位點。進一步研究發現，miR-124 靶向負調控JAG1 的表達。此外，回復實驗結果顯示，過表達JAG1 可逆轉miR-124 過表達對RCC細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的作用。

JAG1 可通過細胞間的相互作用觸發Notch 信號。在宮頸癌、舌癌中，JAG1 表達的升高可激活Notch信號通路，并進一步誘發下游基因的轉錄和翻譯，而上游的miRNA對JAG1的表達和Notch信號通路具有調控作用[22-23]。NICD 是Notch 受體的一種激活形式，通過激活的Notch信號通路可以釋放NICD，從而增加HES1、HES5 等HES 家族表達[24]。HES1 和HES5 對Notch 信號通路至關重要，可以抑制細胞凋亡，促進細胞侵襲、遷移和增殖[25]。本研究結果顯示，miR-124 過表達時，NICD、HES1、HES5 蛋白表達下降，而過表達JAG1 會干擾miR-124 對NICD、HES1、HES5 蛋白表達的抑制作用，揭示miR-124 通過下調JAG1，抑制Notch信號通路的激活。

綜上所述，本研究發現，miR-124 通過抑制JAG1/Notch信號通路，抑制RCC細胞遷移、侵襲和增殖，加速RCC 細胞凋亡，為RCC 的機制研究提供了參考依據。