油酸包覆的Fe3O4納米顆粒與DPPG單層膜的相互作用*

王益祎，朱華澤，劉鑫鑫

(西安科技大學 理學院，西安 710054)

0 引 言

磁性Fe3O4納米顆粒(MNPs)具有優異的生物相容性、化學親和性和超順磁性，在靶向給藥、催化劑、生物傳感器、分離和純化生物分子以及癌癥治療等方面具有廣闊的應用前景[1-6]。納米技術迅速發展的同時增加了納米材料與人類和環境接觸的可能[7]。有研究表明納米顆粒通過呼吸道吸入肺泡后，會直接進入肺表面活性單層膜[8,9]，可能會引起膜的相變、重組和溶解，從而導致人體疾病。因此，探索納米顆粒與生物膜分子之間的相互作用及其對人體產生的影響是一個亟需解決的課題[7]。

研究中常用Langmuir技術模擬單層生物膜，分析納米顆粒的摻入對處于空氣-液體界面的模擬膜的影響。近年來，納米顆粒對脂質單層膜結構和物理化學性質的影響受到廣泛關注[9-13]。Guzman分別研究了二氧化鈦(TiO2)[12]和二氧化硅(SiO2)[13]納米顆粒對DPPC單層膜界面性質的影響，發現TiO2納米顆粒影響了單層膜的動態響應，改變了準平衡擴張彈性和粘彈性模量的高頻極限值；而SiO2納米顆粒使界面分子的平均分子面積減小，改變了DPPC單層膜的橫向堆積和界面上脂質分子之間的內聚力，降低了脂單層膜的力學性能。Chakraborty[9]分別研究了工程碳納米顆粒(ECN)對4種(DPPC/POPC、DPPC/DPPG、DPPC/DOPG和DPPC/DPPE)肺表面活性單層模擬膜在空氣-液體界面的崩潰機制的影響，結果表明，ECN并不影響單層膜的崩潰機制，但是在膜崩潰過程中將肺表面活性物質保留在界面上的能力，以及在壓縮-擴張循環后活性物質重新吸附到界面的能力會不同程度地被ECN改變。Xu[11]研究發現疏水性Fe3O4MNPs與POPC/DPPC混合脂分子尾鏈的排斥作用會導致脂-MNPs復合體溶入亞相；而親水性Fe3O4MNPs與脂質親水頭基的相互作用會增強脂分子間的相互吸引作用。Piosik[1]研究了氨化殼聚糖修飾的MNPs吸附/摻入模擬膜的過程，發現在生理膜壓下(35mN/m)，MNPs可以吸附/摻入DPPC模擬膜中，而且吸附/摻入的MNPs數量可以通過MNPs濃度來調節。上述研究表明，納米顆粒的組成、修飾、親/疏水等性質會對單層膜產生較大影響。MNPs的出現可能會降低磷脂分子在界面上的可用面積，改變單層膜的結構和內聚性，同時影響單層膜的壓縮性和穩定性。

Fe3O4納米顆粒的化學活性高，在空氣中容易被氧化成Fe2O3，且Fe3O4納米顆粒容易聚集，從而失去磁性納米結構的相關特性。因此，在Fe3O4納米顆粒的應用中，常利用有機分子、聚合物、表面活性劑或生物分子對其進行表面改性。油酸分子(OA)的尾鏈中存在一個順式雙鍵，使用OA包覆Fe3O4納米顆粒，可以形成致密的保護層，增強Fe3O4納米顆粒的穩定性和分散性，得到高度均勻和單分散的納米顆粒[10]。本文針對油酸包覆的Fe3O4納米顆粒展開研究。

卵磷脂(PC，電中性)、磷脂酰甘油(PG，帶負電)、磷脂酰乙醇胺(PE，帶正電)是生物膜中常見的幾種磷脂[14]。生物膜中含量最豐富的磷脂DPPC與納米顆粒的相互作用已得到高度關注[1,7,12-15]，但納米顆粒與帶電磷脂分子之間的相互作用尚未得到充分的了解。因此，本文結合Langmuir等溫線實驗、壓縮-擴張實驗、振蕩實驗以及布魯斯特角顯微鏡(BAM)實驗[15]，從表面壓、平均分子面積、壓縮-擴張特性和流變性等方面分析了OA-Fe3O4MNPs與帶負電的DPPG單層膜在空氣-水界面的相互作用，為Fe3O4MNPs的安全應用提供實驗支持[16,17]。

1 實 驗

1.1 實驗材料

二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)購自Corden Pharma公司(德國)，純度99%；油酸包覆的磁性納米顆粒(OA-Fe3O4MNPs)購自西安瑞禧生物有限公司。無水乙醇、甲醇、氯仿等有機溶劑均購自天津富宇精細化工有限公司。實驗用水均采用超純水。

Langmuir-Blodgett(LB)膜分析儀為芬蘭KSV公司的Medium型，槽面積為243 cm2。用Wilhelm板測量表面張力(γ)，精度0.01mN/m. 表面壓(π)定義為π=γw-γ，其中γw為純水的表面張力[9,15]。

DPPG溶解在氯仿/甲醇(3∶1,v/v)溶液中，濃度為0.5mg/mL[15]。OA-Fe3O4MNPs分散在氯仿中形成濃度0.5mg/mL的儲備液[15]，使用前超聲處理5min，避免因MNPs團聚而對實驗造成不利影響[12]。采用恒溫循環水槽控制亞相溫度為(28.0±0.1)℃(HX-105型，長流科學儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 測繪π-A等溫線[1,11,16]

保持DPPG質量不變，改變OA-Fe3O4MNPs的質量，配置按一定質量比混合的實驗樣品(DPPG:OA-Fe3O4MNPs =m∶m′)，用微量進樣器將混合液滴加至純水表面，使其自動鋪展20分鐘，以確保有機溶劑完全揮發。以10 mm/min的速率壓縮單層膜，測繪表面壓-平均分子面積(π-A)等溫線。

1.2.2 測繪Δπ-t曲線[1,11]

將單層膜壓縮至固定表面壓π0=25 mN/m，停止移動滑障，記錄表面壓π(t)隨時間t的變化曲線，計算得到Δπ-t曲線(Δπ=π(t)-π0)。

1.2.3 壓縮-擴張實驗[9,17]

以10 mm/min的速率將單層膜壓縮至50 mN/m，然后以相同的速率擴張單層膜至最大面積，循環3次，記錄表面壓的變化。

1.2.4 振蕩實驗[15]

壓縮單層膜至目標表面壓π0=25 mN/m，停止移動滑障，靜置10 min使單層膜達到平衡狀態。然后滑障以固定振幅按正弦規律振蕩，振蕩頻率5，20，50，80，100，200mHz，記錄表面壓隨時間的變化曲線。

2 結果與討論

2.1 DPPG與OA-Fe3O4 MNPs混合單層膜的熱力學分析

圖1(a)給出了摻入不同濃度的OA-Fe3O4MNPs后，DPPG單層膜的π-A/A1等溫線(A1是DPPG分子在空氣-水界面充分擴散后的平均占有面積[15])。純DPPG單層膜的起始平均分子面積為0.98 nm2，膜由氣相(G)進入液態擴張相(LE)的壓縮比(A/A1)為0.57，單層膜的崩潰壓約56 mN/m。摻入OA-Fe3O4MNPs后，等溫線向平均分子面積增大的方向移動，且起始平均分子面積(圖1(a)Δ標記)也隨之增大，這表明OA-Fe3O4MNPs吸附到空氣-水界面，占據了DPPG分子在界面上的部分可用面積，產生了具有顯著納米顆粒濃度依賴性的排除面積效應(excluded area effects)[15,18]。摻入OA-Fe3O4MNPs后，單層膜的表面壓明顯升高，當A/A1=0.4時，表面壓升高幅度(Δπ0.4)達最大；當DPPG∶OA-Fe3O4MNPs(m∶m′)=2∶1時，Δπ0.4高達25 mN/m。表面壓如此大幅度的升高可能對生物膜系統(如肺表面活性膜)的功能(如呼吸作用)產生明顯的不利影響。表面壓大幅升高與磷脂帶電頭部基團和OA-Fe3O4MNPs的相互作用有關，這可能導致DPPG的凝聚，也可能形成DPPG-OA-Fe3O4MNPs復合體。將OA-Fe3O4MNPs摻入DPPG單層膜后，未觀察到單層膜崩潰壓(πc)的明顯變化，πc值均集中在56 mN/m左右，納米顆粒的加入并未改變DPPG單層膜的崩潰機制。Piosik[1]研究發現氨基殼聚糖修飾的Fe3O4MNPs對DPPC單層膜的崩潰壓亦無明顯影響。Chakraborty[9]研究了工程碳納米顆粒與二元磷脂混合單層膜的相互作用，發現二元混合膜的崩潰機制也沒有受到明顯影響。隨著OA-Fe3O4MNPs濃度的增加，DPPG單層膜的極限分子面積(Aext)隨之增大，該現象也出現在由氨基殼聚糖修飾的Fe3O4MNPs與DPPC組成的單層膜體系中[1]。由此可見，納米顆?？蓪α字瑔螌幽さ臉O限分子面積產生顯著影響，而且這種影響與納米顆粒的濃度相關聯。

圖1 DPPG與OA-Fe3O4 MNPs混合單層膜的π-A/A1等溫線(a)及CS-1-π曲線(b)Fig.1 π-A/A1 isotherms and CS-1-π curves of mixed monolayers of DPPG and OA-Fe3O4 MNPs

利用BAM實時監測了單層膜的成膜過程，觀察單層膜的表面結構特征。圖2(a)-(e)為π=10 mN/m時純DPPG及DPPG:OA-Fe3O4MNPs(m∶m′)=20∶1、10∶1、8∶1和2∶1的單層膜的BAM圖像。結果發現，溫度為28 ℃時，純DPPG單層膜結構均勻，BAM圖呈現整齊排列的圓形微區結構(圖2(a))，DPPG單層膜在10 mN/m的壓力下可能處于并不顯著的LE-LC相變共存區。這與D.Vollhardt[21]發現溫度處于26～37 ℃之間時，DPPG僅在LE-LC相變共存區呈現規則形狀的微區結構一致。當DPPG:OA-Fe3O4MNPs (m∶m′) =20∶1時，混合單層膜中可見明顯的OA-Fe3O4MNPs顆粒狀結構(圖2(b))，顆粒之間存在黑色間隙，而在圖2(a)中出現過的圓形微區消失。BAM圖像中還存在面積較大的明亮區域(見紅色圈標記)。根據BAM成像原理可知上述標記區域中膜的厚度顯著增加，推測這是由于DPPG與OA-Fe3O4MNPs形成了復合體。隨著OA-Fe3O4MNPs濃度的增加(10∶1和8∶1)，BAM圖像呈現出大量的顆粒結構(圖2(c),(d))。但當DPPG:OA-Fe3O4MNPs(m∶m′)=2∶1時，膜中顆粒狀結構消失(圖2(e))。當π=25 mN/m時，單層膜的BAM圖像如圖2(a′)-(e′)所示。純DPPG單層膜在該表面壓下處于LC相(圖1(b))，界面上整齊排列的圓形微區結構消失，形成均勻的單層膜(圖2(a′))，其界面分子的可能排列如圖3(a)所示。當DPPG:OA-Fe3O4MNPs (m∶m′)=20∶1和10∶1時，單層膜中的顆粒狀結構排列得更加緊密(圖2(b′),(c′))，且質量比10∶1單層膜的BAM圖像中明亮區域的數量更多、面積增大，這說明隨著MNPs濃度的增加，單層膜中形成的復合體增多，單層膜部分區域的厚度增加。當質量比為8∶1時，單層膜的BAM圖像右上角區域的亮度明顯高于左下角(圖2(d′))，說明在復合體持續增多的過程中，復合體與DPPG分子出現相分離現象，導致單層膜的厚度不均。在質量比為2∶1的BAM圖像中沒有出現明顯的相分離現象，界面上形成了均勻、致密的單層膜(圖2(e′))，但與圖2(a′)中的DPPG單層膜相比，混合單層膜的亮度增大，這表明大量的DPPG-OA-Fe3O4MNPs復合體與DPPG在界面形成了混合膜，界面上可能的分子組成如圖3(d)所示。

圖2 DPPG與OA-Fe3O4 MNPs混合單層膜的BAM圖像Fig.2 BAM images of mixed monolayers of DPPG and OA-Fe3O4 MNPs: (a),(a′)DPPG,(b),(b′)DPPG:OA-Fe3O4 MNPs(m:m′)=20∶1,(c),(c′)10∶1, (d),(d′)8∶1,(e),(e′)2∶1

圖3 混合單層膜的界面行為示意圖Fig.3 The schematic diagram of mixed monolayers at the interface: (a)DPPG,(b)DPPG:OA-Fe3O4 MNPs(m∶m′)=20∶1,(c)8∶1,(d)2∶1

2.2 DPPG與OA-Fe3O4 MNPs混合單層膜的動力學研究

為了研究磁性OA-Fe3O4MNPs對DPPG單層膜結構穩定性的影響，測量了OA-Fe3O4MNPs摻入DPPG單層膜的動力學信息。圖4(a)給出了π=25 mN/m時，OA-Fe3O4MNPs與DPPG單層膜分子間相互作用過程的表面壓-時間曲線(Δπ-t)。隨著時間增加,表面壓均呈現逐漸減小的趨勢。經歷1 h，Δπ隨OA-Fe3O4MNPs濃度的變化情況如圖4(b)所示。純DPPG單層膜的表面壓在1h內變化很小，約減小了3.5 mN/m，這主要歸因于界面有微量的磷脂分子損失進亞相中。而在DPPG單層膜中摻入OA-Fe3O4MNPs后，隨著MNPs濃度增加，Δπ變大。當DPPG: OA-Fe3O4MNPs(m∶m′)=8∶1時，Δπ達最大，約7.8 mN/m，這是由于界面上的DPPG分子與OA-Fe3O4MNPs形成復合體[22]，減小了DPPG分子在界面的占有面積，表面壓隨之降低，如圖3(b),(c)所示。另有部分復合體從界面損失到亞相，導致表面壓持續減小[19,22-23]。當DPPG:OA-Fe3O4MNPs(m∶m′)=2∶1時，表面壓減小約5 mN/m，這是由于DPPG與高濃度的OA-Fe3O4MNPs形成大量復合體，在部分復合體損失到亞相后，界面上仍吸附有大量復合體，因此與質量比8∶1的單層膜相比，表面壓下降幅度有所減小(圖3(d))。

在研究DPPG單層膜的壓縮-擴張動態過程時，首先將DPPG單層膜壓縮至50 mN/m(避免單層膜完全崩潰)，隨即擴張循環。在壓縮過程中，部分DPPG從界面擠出，但擴張后又會緩慢地重新吸附到界面上，這導致DPPG單層膜的壓縮和擴張曲線中出現滯回現象(圖5(a))，這一現象也出現在循環壓縮DPPC單層膜的實驗中[17]。利用壓縮-擴張循環實驗進一步研究了OA-Fe3O4MNPs在DPPG單層膜中的擠出和再吸附過程(圖5(b)-(d))。在DPPG:OA-Fe3O4MNPs(m∶m′)=10∶1和8∶1的單層膜中，擴張曲線存在明顯滯后現象(圖5(b),(c))，說明界面上有分子被擠出到亞相，這與動力學研究結果一致(圖4(a))；3次壓縮-擴張曲線基本重合，特別是在高表面壓區(π>20 mN/m)完全重合，這表明從界面擠出的分子依然會緩慢地重新吸附到界面上，空氣-水界面上的膜組分具有動態穩定性[19,24]。值得注意的是，當DPPG∶OA-Fe3O4MNPs (m∶m′)=2∶1，表面壓π>28 mN/m時，第2、3次壓縮-擴張曲線向平均分子面積更大的方向移動。增加循環次數，發現第4、5次壓縮-擴張曲線亦有相同的移動現象(圖5(d))。這可能與DPPG-OA-Fe3O4MNPs復合體的形成有關，形成復合體的DPPG分子和MNPs在擴張過程中并不能重新分開，而再次壓縮時又有新的復合體形成，最終導致曲線在高表面壓區間向右移動。實驗中，DPPG-OA-Fe3O4MNPs復合體的形成可能受表面壓和OA-Fe3O4MNP濃度的共同影響，為此我們考察了DPPG:OA-Fe3O4MNPs(m∶m′)=5∶1的體系，發現壓縮-擴張曲線在第2、3次的壓縮-擴張仍然向右移(圖5(c)插圖)。

圖4 混合單層膜在固定表面積下的Δπ-t曲線(a)及弛豫1h后Δπ隨MNPs濃度的變化情況(b)Fig.4 Δπ-t curves of mixed monolayer at constant A and the variation of Δπ with the concentration of MNPs after relaxation for 1 h

圖5 混合單層膜的壓縮-擴張曲線Fig.5 Compression-expansion curves of mixed monolayers: (a)DPPG,(b)DPPG:OA-Fe3O4 MNPs (m∶m′)=10∶1,(c)8∶1,(d)2∶1

2.3 DPPG與OA-Fe3O4 MNPs混合單層膜的流變響應

為了分析OA-Fe3O4MNPs對空氣-水界面上DPPG單層膜粘彈性的影響，測量了在固定應變(u0=ΔA/A=5%)、固定表面壓(25 mN/m)和恒定頻率(f=20，50，100 mHz)下單層膜的振蕩曲線?？刂苹弦院愣l率f振蕩，平均分子面積的應變為[25-26]：

ut=A0[1+u0sin(2πft+φu)]

(1)

則單層膜的應力為[26]：

πt=π0+π1sin(2πft+φπ)

(2)

式中：A0為π0=25 mN/m時的平均分子面積，π1為應力幅值，φu、φπ分別為ut、πt的相位。振蕩過程中單層膜的擴張彈性模量E′和粘性模量E″有如下關系[26]：

(3)

式中：E*是單層膜的擴張粘彈性，φ=φu-φπ是應力與應變的相位差。

實驗發現，應力與應變曲線的相位差均為φ=0，代入公式(3)可知擴張粘彈性中的虛部為零，這表明該混合單層膜的粘彈性以彈性為主[26]。圖6給出了DPPG: OA-Fe3O4MNPs(m∶m′)=20∶1，振蕩頻率為20mHz時單層膜的應變、應力實驗曲線(虛線)，利用公式(2)對應力曲線進行擬合(圖6(b)實線)，結果顯示實驗曲線與擬合曲線基本吻合，但值得注意的是實驗曲線在峰值處出現畸變，這表明單層膜在振蕩過程中的應力可能存在非線性響應[27]。利用快速傅里葉變換(FFT)對應力曲線進行頻譜分析，發現頻譜中存在2次諧波、3次諧波和5次諧波(圖6(c))，這證實了單層膜應力對應變的非線性響應[12]。上述現象也存在于其它幾種質量比和振蕩頻率的實驗體系中。綜上，DPPG單層膜中摻入OA-Fe3O4MNPs后，單層膜的應力對應變存在非線性響應。

圖6 振蕩實驗中的應變曲線(a);表面壓的應力曲線(b);應力曲線的FFT頻譜(c)Fig.6 (a) Strain curve in oscillation experiment; (b) stress curve of surface pressure; (c)FFT spectrum of stress cure

為了進一步研究OA-Fe3O4MNPs濃度與單層膜應變響應的關系，測繪了3個振蕩周期的應力與應變關系曲線，得到應力-應變李薩如圖(圖7)[27-28]。圖7顯示，各單層膜3個周期的李薩如圖均相互重合。對于純DPPG單層膜，各頻率的李薩如圖均表現為正滯回曲線(圖7(a)-(a″))，說明在振蕩過程中，壓縮使單層膜中的DPPG分子排列更加有序，表面壓增大[25]；振蕩頻率越高，李薩如圖的滯回面積越大，這說明單層膜的粘性有所增加[29]；雖然DPPG單層膜是彈性膜，但當振蕩頻率較高時(100 mHz)，振蕩壓縮首先使單層膜的有序性增加，表面壓增大，然而界面快速擴張時表面壓降低的速度比壓縮時表面壓增大的速度慢，導致李薩如圖的滯回面積增加，反應了單層膜存在微弱的粘性特征。

圖7(b)-(e)，(b′)-(e′)，(b″)-(e″)顯示,4種不同質量比例混合的單層膜在各振蕩頻率下的李薩如圖均出現交叉現象，說明單層膜應力對應變的響應均是非線性的，這是由于OA-Fe3O4MNPs破壞了DPPG單層膜的均勻性(如圖2(d′))，引起了應力的非線性響應，這與a-PMMA單層膜體系相似[25]。當DPPG:OA-Fe3O4MNPs(m∶m′)=2∶1時，混合單層膜的李薩如圖均呈現負滯回曲線(圖7(f)-(f″))，這是由于在振蕩過程中，壓縮使單層膜的部分分子從界面擠出，表面壓降低[25]。負滯回曲線中沒有出現交叉現象，且壓縮和擴張曲線的對稱性優于其他比例的混合單層膜，說明該條件下單層膜的應力對應變響應的非線性成分減少，兩種組分在空氣-水界面形成了均勻致密的單層膜，這與BAM圖像一致(圖2(e′))。

圖7 DPPG與OA-Fe3O4 MNPs混合單層膜的李薩如圖，箭頭表示李薩如圖的前進方向Fig.7 Lissajous plots of mixed monolayer of DPPG and OA-Fe3O4 MNPs. An arrow in the figure indicates the forward direction of the Lissajous plots: (a)-(a″)DPPG,(b)-(b″)DPPG:OA-Fe3O4 MNPs(m∶m′)=30∶1,(c)-(c″)20∶1,(d)-(d″)10∶1,(e)-(e″)5∶1,(f)-(f″)2∶1

即使實驗考慮的條件與典型的呼吸周期(更高的頻率和變形幅度)還有很大區別，但是探索納米顆粒對DPPG單層膜的影響有助于評估納米顆粒對生物膜，特別是肺表面活性膜功能的影響。通過分析粘彈性模量的頻率依賴性來探索單層膜的流變響應，能夠獲得納米顆粒對磷脂單層膜平衡過程中所涉及的弛豫機制的影響信息[30]。

利用式(4)由應力-應變曲線可得單層膜的粘彈性模量[26]，根據公式(5)對粘彈性模量的實驗值進行理論擬合[12,15,30]：

(4)

(5)

圖8 DPPG與OA-Fe3O4 MNPs混合單層膜在不同頻率下的粘彈性模量，圖中實線為根據(5)式擬合的理論曲線Fig.8 Viscoelastic modulus of DPPG and OA-Fe3O4 MNPs mixed monolayers at different frequencies. The solid lines in the figure are the theoretical curves fitted according to formula(5)∶ (a)DPPG,(b)DPPG∶OA-Fe3O4 MNPs(m∶m′) =20∶1,(c)10∶1,(d)2∶1

圖9 特征頻率與OA-Fe3O4 MNPs濃度的關系Fig.9 Relaxation frequency dependences of concentration of OA-Fe3O4 MNPs

為了探明OA-Fe3O4MNPs濃度對單層膜弛豫過程的影響，圖9給出了特征頻率f1隨OA-Fe3O4MNPs濃度的變化關系[15]。在實驗頻率范圍內，隨著單層膜中OA-Fe3O4MNPs濃度的增加，f1在10-3Hz上下波動。由此可知，當π=25 mN/m、振蕩頻率在10-3～10-1Hz之間時，DPPG與OA-Fe3O4MNPs混合單層膜弛豫過程的時間尺度受OA-Fe3O4MNPs濃度的影響并不顯著。

3 結 論