谷氨酸棒桿菌中烷基過氧化物還原酶(CgAhp)抵御環境脅迫的作用機制*

李海燕, 胡夢蝶, 劉 洋, 時玉珠, 廖鑫鳴, 司美茹

(曲阜師范大學生命科學學院,273165,山東省曲阜市)

0 引 言

活性氧(ROS)是光合作用和呼吸代謝等正常代謝過程中產生的有毒副產物,受到氧化劑、低pH值、重金屬、高溫、聯胺(diamide)和抗生素等不利環境刺激的誘導[1]. 活性氧是一種高反應性分子,如過氧化氫(H2O2)、超氧陰離子(O2·-)和有機過氧化物等,能夠對蛋白質、DNA和細胞膜進行修飾并造成不同程度的損傷,甚至導致細胞內氧化還原穩態破壞并引發氧化應激[2]. 在一定條件下活性蛋白結構的改變或由于蛋白活性需要巰基的特異性氧化,2個半胱氨酸巰基之間形成二硫鍵使蛋白失活[3]. 為了對抗ROS毒性,細胞產生各種抗氧化酶,以持續監測細胞內氧化還原狀態的變化并促進蛋白的正確折疊[4].

ROS的酶清除系統涉及不同細胞區室中的許多酶催化反應. 從古細菌、低等原核生物到高等真核生物中發現基于硫醇的過氧化物酶構成了一個大家族,包括過氧化物酶(Prx)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和有機醇過氧化物酶(Ohr)[5,6]. 基于硫醇的過氧化物酶通過保守的活性半胱氨酸殘基代謝過氧化物時,這些殘基會發生氧化. 為了完成催化循環,必須對半胱氨酸殘基進行還原. 這些過氧化物酶依賴不同的還原系統,包括烷基氫過氧化物還原酶亞基F(AhpF)；硫氧還蛋白(Trx)和硫氧還蛋白還原酶(TrxR)；分枝硫醇氧化還原酶(Mrx1)、硫醇二硫化物交換蛋白類分枝硫醇氧化還原酶(DsbA-like Mrx1)、分枝硫醇還原酶(Mtr)、分枝硫醇(MSH)；烷基過氧化物還原酶D(AhpD)、二氫硫辛酰胺脫氫酶(Lpd)、二氫硫辛酰胺琥珀酰轉移酶(SucB)[7,8]等. 氧化過氧化物酶二硫氧化還原酶,如AhpF,Trx,Mrx1,DsbA-like Mrx1和AhpD,是還原系統的核心成員,直接與氧化過氧化物酶相互作用并將電子轉移到氧化過氧化物酶.

由4種不同亞單位AhpC,AhpD,AhpE和AhpF組成的烷基過氧化物還原酶Ahp是一類二硫鍵氧化還原酶的已知成員[9],也是具有傳播自由基鏈式反應和直接解毒ROS能力的巰基依賴性Prx家族的成員[10]. 細菌中的AhpC和AhpE催化H2O2、叔丁基過氧化氫(t-BHP)、異丙苯過氧化氫(CHP)和過氧亞硝酸鹽的還原[11,12]. AhpF是一種具有氧化還原酶活性的黃素蛋白,可將氧化的AhpC還原為還原形式[8]. 在一些不含ahpF的細菌中,ahpD與ahpC或ahpF都沒有序列相似性,但在分枝桿菌和除蟲鏈霉菌中起到與ahpF類似的作用[9].因此,ahp的表達在氧化應激中起重要作用. 谷氨酸棒桿菌是一種工業重要的革蘭氏陽性細菌,它含有3種Ahp同系物[NCgl2286(AhpD1),NCgl2349(AhpD2),NCgl0877(假定的Ahp)][13]. 谷氨酸棒桿菌AhpD1和AhpD2能協同Lpd/SucB/NADH系統通過自身活性位點二硫醇再生多種硫醇依賴性過氧化物酶[14],但有關NCgl0877的研究很少. 最近,Si等人發現NCgl0877是OsaR(有機過氧化物和抗生素敏感調節劑)的主要靶點之一,而OsaR參與氧化應激反應[15]. NCgl0877具有Cys-Pro-Gly-Cys(C-P-G-C)活性位點,與AhpDs中的C-G-T-C或C-V-Y-C不同. 前期研究發現,CXXC基序中半胱氨酸之間的2個中間殘基的差異會引起過氧化物酶二硫鍵還原酶的酶促反應速度和底物偏好特性不同[16]. 因此,新C-P-G-C活性位點的發現促使研究NCgl0877(即CgAhp)在谷氨酸棒桿菌抗氧化中的作用.

1 材料與方法

1.1 菌株和生長條件

本研究使用的菌株和質粒列于表1[17,18]. 采用Luria-Bertani(LB)肉湯和平板分別在37 ℃和30 ℃下培養大腸桿菌或谷氨酸棒桿菌RES167. 根據司美茹[4]的方法制備Δcgahp基因缺失菌株和相應互補菌株. 含500 mM山梨糖醇(BHIS)的腦心浸液肉湯培養基用于產生和維持谷氨酸棒桿菌RES167中基因的突變體[19]. 在培養基中加入0.5 mM異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(Sigma-Aldrich)誘導互補菌株中pXMJ19-cgahp衍生物上cgahp基因的表達. 大腸桿菌DsbA來自廣東深圳市鑫博生生物科技有限公司. 抗生素添加濃度為：卡那霉素,大腸桿菌50 μg/mL,谷氨酸棒桿菌25 μg/mL；萘啶酮酸,谷氨酸棒桿菌40 μg/mL；氯霉素,大腸桿菌20 μg/mL,谷氨酸棒桿菌10 μg/mL.

表1 菌株、質粒和引物

1.2 質粒構建

本研究使用的引物如表1所示. 采用引物對Ocgahp-F和Ocgahp-R從谷氨酸棒桿菌 RES167基因組DNA中擴增出谷氨酸棒桿菌cgahp基因(ncgl0877)區域并克隆到EcoRI和XhoI位點之間的pET28a載體中,得到pET28a-cgahp.

利用引物對Dcgahp-F1/Dcgahp-R1和Dcgahp-F2/Dcgahp-R2采用兩步重疊PCR方法構建讀碼框缺失483-bp的DNA片段,并進行雙酶切插入自殺質粒pK18mobsacB中獲得pK18mobsacB-Δcgahp[20].

利用引物對Ccgahp-F/Ccgahp-R從谷氨酸棒桿菌基因組DNA中擴增cgahp基因開放閱讀框區DNA片段,獲得pXMJ19-cgahp. 將得到的DNA片段用SalI和BamHI進行剪切,然后克隆到SalI和BamHI位點之間的pXMJ19載體上.

1.3 重組蛋白的過表達和純化

將BL21(DE3)(pET28a-cgahp)菌株在含有卡那霉素(50 μg/mL)的LB培養基中進行37 ℃、220 rpm振蕩培養. 當OD600 nm為0.6時,加入0.5 mM IPTG,22 ℃培養10 h后,4 ℃離心收集細胞. 細胞顆粒懸浮在30 mL裂解緩沖液中[10 mM Tris(pH 6.8),10%甘油和10 mM β-巰基乙醇(β-ME)]經超聲處理,10 000×g離心60 min. 用His?Bind Ni-NTA樹脂(Novagen,Madison,WI)純化上清中的目標蛋白. 純化的His6-tag蛋白在4 ℃下用PBS透析濃縮,用于進一步的實驗[通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)估計純度大于95%].

1.4 氧化劑、烷化劑、重金屬和還原劑敏感性檢測

根據Rawat等人[21]的研究,采用紙片擴散對菌株的藥劑敏感性進行分析. 取100 μL對數中期的培養物(約107cfu)涂在LB平板上,然后將10 μL試劑原液浸泡過的濾紙片輕輕放于LB平板上. 試劑原液為200 mM H2O2,0.5 mM次氯酸(HClO),5 mM diamide,11 mM CHP,60 mMt-BHP,70 mM 1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB),1 mM碘乙酰胺(IAM),25 mg/mL鏈霉素(STR),5 mg/mL環丙沙星(CIP),0.5 mM氯化鎘(CdCl2)和10 mM硫酸鎳(NiSO4). 在30 ℃下孵育2～3 d,測量抑菌圈的直徑. 實驗至少進行3個獨立生物學重復.

1.5 氧化型CgAhp-S2的體外制備

根據Van Laer等人[22]的方法制備氧化型CgAhp-S2(含分子內二硫鍵的CgAhp).

1.6 TrxR/NADPH,MSH/Mtr/NADPH和Lpd/SucB/NADH途徑氧化CgAhp-S2的穩態動力學研究

在340 nm(ε340=of 6220 M-1cm-1)處連續監測TrxR/NADPH、MSH/Mtr/NADPH或Lpd/SucB/NADH途徑中NADPH或NADH作用的氧化型CgAhp-S2依賴性氧化,反應混合物為300 μL,含有50 mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.5),1 mM EDTA,不同濃度的氧化型CgAhp-S2和可能作為電子供體的還原Trx生成系統[5 μM TrxR、40 μM Trx、300 μM NADPH]、MSH系統[5 μM Mtr,500 μM MSH,300 μM NADPH]或Lpd系統[5 μM Lpd,5 μM SucB,300 μM NADH]. 反應均于37 ℃進行. 在于37 ℃溫育3 min后的反應混合物中加入氧化型CgAhp-S2開啟反應. 以不含CgAhp-S2作為對照.kcat和Km值通過GraphPad Prism 5程序對Michaelis-Menten方程進行非線性擬合獲得.

1.7 CgAhp協同Lpd/SucB/NADH電子途徑還原過氧化物酶活性測定

參照王建波等人[18]的方法進行活性測定.

1.8 統計分析

統計分析是通過成對的雙尾學生t檢驗確定的. 用GraphPad Prism Software進行統計分析(GraphPad Software,San Diego California USA).

2 結果與討論

2.1 CgAhp的特性

谷氨酸棒桿菌ncg10877基因位于bp 969458至969940之間,編碼由160個氨基酸殘基組成的假定Ahp,分子量為18.0 kDa. 如圖1所示,NCgl0877蛋白與Achromobacterxylosoxidans、Nitrosococcuswatsonii,Citrobacterfreundii,Simplicispirasuum和CandidatusNitrosoglobus中Ahp的Cys-XX-Cys活性位點氨基酸序列相似性分別為51.3%、53.9%、52.9%、50.0%和52.4%.

圖1 CgAhp與其他生物體中Ahp的多序列比對

迄今為止,Ahp蛋白根據功能特征分為2類：二硫化物氧化還原酶包括2-Cys AhpD和1-Cys AhpF,以及巰基過氧化物酶家族的Prx,包括AhpC和AhpE[10,23]. 根據氨基酸序列,進一步發現谷氨酸棒桿菌的NCgl0877與2-Cys AhpD共享一個高度保守的Cys-X-X-Cys(C-X-X-C)催化特征基序,這與具有2個活性半胱氨酸的過氧化物酶不同,例如AhpC這一過氧化物(如圖1B). AhpC通過保守的N末端半胱氨酸殘基(Cp)分解過氧化物而被氧化. 為了完成催化循環,氧化性Cp會被C端半胱氨酸殘基CR還原,導致AhpC形成分子內二硫鍵[12,24]. 2-Cys AhpD通過Cys-X-X-Cys活性位點的N端和C端Cys將氧化的過氧化物酶恢復為還原態[14]. 因此,推測谷氨酸棒桿菌的NCgl0877可能作為氧化態過氧化物酶的還原酶,而不是充當過氧化物酶.

根據CXXC催化基序,迄今為止報道的谷氨酸棒桿菌過氧化物酶的還原酶可以分為7種：Trx[Cys-Gly-Pro-Cys(C-G-P-C)],Mrx1[Cys-Pro-Tyr-Cys(C-P-Y-C)],AhpD[Cys-Gly-Thr-Cys(C-G-T-C),Cys-Val-Tyr-Cys(C-V-Y-C)],DsbA-like Mrx1[Cys-Pro-Phe-Cys(C-P-F-C)],NrdH[Cys-Val-Gln-Cys(C-V-Q-C)]和Mrx3 [Cys-Gly-Ser-Cys(C-G-S-C)](如圖1B). NCgl0877形成了1個新的種類,保留了Cys-Pro-Gly-Cys(C-P-G-C)活性位點. 此外如圖1B所示,NCgl0877的CXXC 催化基序中2個半胱氨酸之間的殘基與Mrx1(C-P-Y-C)和DsbA-like Mrx1(C-P-F-C)更相似,而與AhpD(C-G-T-C或C-V-Y-C)不同. 以前的研究表明,催化CXXC基序中2個半胱氨酸間插入殘基的差異導致二硫鍵氧化還原酶具有不同的酶促反應速率和底物偏好特性[16]. 因此,新型C-P-G-C活性位點的發現促使研究谷氨酸棒桿菌NCgl0877. 根據其類似于二硫化物氧化還原酶的活性行為,將其命名為CgAhp.

2.2 cgahp的缺失突變體對有機過氧化物脅迫敏感

最近,Si等人發現谷氨酸棒桿菌的cgahp基因是OasR的主要靶點之一,它與谷氨酸棒桿菌的氧化應激反應密切相關[15]. 因此,推測CgAhp也可能在氧化應激中發揮作用. 為了了解CgAhp在氧化應激抗性反應中的生理功能,通過同源重組基因敲除獲得的谷氨酸棒桿菌 RES167 菌株中cgahp缺失突變體,并以紙片擴散實驗測定其抗ROS的表型. 如圖2所示,由帶有氧化應激誘導試劑的紙片(φ=5 mm)引起的含有高拷貝數空質粒pXMJ19的谷氨酸棒桿菌RES167親本菌株(該菌株命名為WT)、Δcgahp(pXMJ19)突變株(缺乏cgahp基因的菌株含有空的pXMJ19)和Δcgahp(pXMJ19-cgahp)(Δcgahp被攜帶野生型cgahp基因的質粒補充)的抑制區直徑(cm). 點圖顯示了每種試劑的3個樣本的平均值和標準誤差. 插圖顯示了正常條件下菌株的生長曲線. 通過在指定時間點測量A600來監測LB中指定菌株的生長.

圖2 谷氨酸棒桿菌的Δcgahp菌株對有機過氧化物脅迫更敏感

在正常生長條件下CgAhp被認為在谷氨酸棒桿菌RES167中是非必需的,但與WT(pXMJ19)菌株(含有空質粒pXMJ19的野生型谷氨酸棒桿菌菌株)相比,Δcgahp(pXMJ19)菌株(含pXMJ19空質粒且缺失cgahp的突變體)對CHP和t-BHP的耐受性降低,其抑菌圈明顯大于WT(pXMJ19)菌株. 為了證實其敏感性是由于缺少cgahp基因造成的,將含有野生型谷氨酸棒桿菌cgahp基因的質粒pXMJ19引入Δcgahp缺失突變體中,構建互補菌株Δcgahp(pXMJ19-cgahp),并進行互補實驗. 如圖2所示,互補菌株Δcgahp(pXMJ19-cgahp)在CHP和t-BHP下產生明顯小的抑菌圈,與WT(pXMJ19)菌株相當,其抗性表型幾乎完全在Δcgahp(pXMJ19-cgahp)菌株中恢復. 然而WT(pXMJ19)、Δcgahp(pXMJ19)和Δcgahp(pXMJ19-cgahp)菌株在H2O2、HClO,diamide,CDNB,IAM,STR,CIP,CdCl2和NiSO4脅迫下無顯著性差異. 因此,CgAhp參與抗有機過氧化物脅迫的過程.

2.3 氧化型CgAhp優先利用Lpd/SucB/NADH電子途徑再生

谷氨酸棒桿菌通過MSH/Mtr/NADPH系統、TrxR/NADPH系統和Lpd/SucB/NADH系統3種普遍存在的電子轉移途徑來還原氧化還原酶活性位點半胱氨酸之間的二硫鍵,為了確定可能與氧化CgAhp還原耦聯的電子供體途徑. 首先用聯胺制備CgAhp-S2,其活性位點半胱氨酸之間有單個二硫鍵(CgAhpox). 再添加CgAhp-S2作為電子轉移途經的底物測定穩態動力學.

圖3 氧化的CgAhp-S2優選通過Lpd/SucB/NADH途徑還原

使用GraphPad Prism 5程序,通過Michaelis-Menten穩態動力學評估MSH/Mtr/NADPH(A),TrxR/NADPH(B)或Lpd/SucB/NADH(C)途徑對氧化型CgAhp-S2的還原. 數據表示為3個獨立實驗的平均值±SD表示. 將不同濃度的氧化CgAhp-S2與預培養的反應混合物混合.

如圖3所示,CgAhp-S2對于MSH/Mtr/NADPH,TrxR/NADPH或Lpd/SucB/NADH電子供體途徑的Km值、Kcat值和催化系數分別為12.51±2.37 μM,0.03±0.002 s-1和(2.39±0.08)×103M-1s-1,4.85±0.89 μM,0.11±0.01 s-1和(2.27±0.13)×104M-1s-1,1.21±0.13 μM,19.61±0.39 s-1和(1.63±0.04)×107M-1s-1. 雖然CgAhp-S2可通過上述3種電子途徑被還原,但CgAhp-S2與Lpd/SucB/NADH途徑的催化系數比TrxR/NADPH和MSH/Mrt/NADPH途徑的催化系數高幾個數量級,表明CgAhp-S2更傾向于Lpd/SucB/NADH途徑. 因此,CgAhp-S2主要通過Lpd/SucB/NADH還原系統來還原,這與Su等人針對谷氨酸棒桿菌AhpDs報告的結果一致[14].

2.4 CgAhp協同Lpd/SucB/NADH電子途徑還原過氧化物酶

為確定CgAhp是否能夠再生硫醇依賴性過氧化物酶,在飽和濃度的過氧化物和不同濃度的CgAhp(0～500 μM)下,協同CgAhp/Lpd/SucB/NADH還原系統進行了過氧化物酶活性的測定.

表2 CgAhp具有硫醇依賴性過氧化物酶還原能力

通過CgAhp系統(0～500 μM CgAhp,5 μM Lpd,和5 μM SucB)對過氧化物(500 μM的MPx and Prx,或1 mM的Ohr和OsmC)和過氧化物酶(0.5 μM MPx和Prx,或0.1 μM Ohr和OsmC)進行過氧化物酶測定. 數據為3次獨立測定值的平均值,并使用GraphPad Prism 5程序進行非線性回歸分析. ND表示在使用的條件下沒有可檢測到的活性.

如表2所示,MPx協同CgAhp/Lpd/SucB/NADH系統對CHP的Kcat和Km值分別為4.11±0.53 s-1和28.92±0.31 μM. 獲得催化效率14.27×104M-1s-1與谷氨酸棒桿菌中AhpD2對MPx(約34.7× 104M-1s-1)的數據相似[14]. 在以CgAhp/Lpd/SucB/NADH體系為電子受體還原Prx、Ohr和OsmC中也觀察到類似的結果. CgAhp/Lpd/SucB/NADH系統中Prx、Ohr和OsmC對CHP的催化效率分別為9.3×104M-1s-1,106.9×104M-1s-1和186.3×104M-1s-1. 雖然CgAhp/Lpd/SucB/NADH系統在以H2O2為底物時支持MPx和Prx的過氧化物酶活性,但催化活性相對低. 當H2O2作為底物時,CgAhp/Lpd/SucB/NADH還原系統對Ohr和OsmC活性的促進作用非常差,這與Si等人分別報導的谷氨酸棒桿菌中僅有且主要是用于有機過氧化物解毒的Ohr和OsmC的結果相一致[25,26]. 與谷氨酸棒桿菌AhpD1和AhpD2一樣,CgAhp具有更廣泛的還原能力[14]. 它不僅能再生有機過氧化物解毒過氧化物酶,還能再生無機過氧化物解毒過氧化物酶. 盡管先前的研究表明Ohr和OsmC可以采用Trx再生系統還原底物CHP(Ohr和OsmC的催化效率分別為10×104M-1s-1和21.2×104M-1s-1),但它們在體外對CgAhp的親和力高于Trx. 這些數據表明CHP而非H2O2作為底物時,CgAhp/Lpd/SucB/NADH系統更有效地支持Ohr和OsmC的活性. 此外,CgAhp優先支持Ohr和OsmC的活性. 當使用CHP作為底物時,MPx和Prx在CgAhp/Lpd/SucB/NADH體系中的催化效率顯著低于谷氨酸棒桿菌MPx和Prx在Trx體系中的催化效率(MPx,58.5×104M-1s-1；Prx,264.1×104M-1s-1)[27,28],比谷氨酸棒桿菌Ohr和OsmC催化CgAhp/Lpd/SucB/NADH體系的反應低約8～20倍. 綜上所述,CgAhp優選還原依賴NADH的過氧化物酶Ohr和OsmC；CgAhp具有更廣泛的還原能力；CgAhp是一種重要的胞質烷基過氧化氫氧化還原酶,參與過氧化物酶的再生.

3 結 語

在本研究中,通過生理生化分析揭示了一種新的烷基過氧化氫還原酶CgAhp. CgAhp增強了谷氨酸棒桿菌對有機過氧化物脅迫的抗性. CgAhp優先通過耦聯Lpd/SucB/NADH電子途徑,將各種氧化態過氧化物酶還原. 另外,CgAhp能更有效地支持有機過氧化物清除酶Ohr和OsmC的活性. 因此,CgAhp屬于二硫化物氧化還原酶的成員,而不是硫醇特異性抗氧化蛋白過氧化物酶家族的成員. 簡而言之,本研究首次證明具有一個新的C-P-G-C活性位點的CgAhp代表了一類類似AhpD的分子,主要通過維持Ohr和OsmC的過氧化物酶活性來實現谷氨酸棒桿菌的抗氧化防御. 同時本研究為其他生物體類似酶的正確分類鋪平了道路,并擴大了二硫化物氧化還原酶的類型.