外泌體在惡性腫瘤發生發展中的作用及臨床應用

儲鉅航， 錢明平

(1. 同濟大學醫學院，上海 200092； 2. 同濟大學附屬第十人民醫院甲乳科，上海 200072)

外泌體是由多囊泡體(multivesicular bodies， MVBs)與細胞膜融合后向細胞外分泌的納米級膜性囊泡，平均大小為100 nm，可攜帶多種具有生物活性的物質，以介導細胞間復雜的細胞通信來維持正常生理狀態或誘發疾病[1]。受體細胞攝取外泌體的方式有配體受體相互作用、吞噬作用、內吞作用和質膜融合等，見圖1。最初發現時，這些細胞外囊泡只被認為是清除細胞碎片的垃圾處理器，它們在許多重要生物過程中所發揮的作用多年來一直被低估。2007年，Valadi等[2]率先描述了外泌體能夠在細胞之間攜帶和轉移mRNA和microRNA，確立了它們作為細胞間信息傳遞載體的作用。新近研究表明[3-5]外泌體在機體生理或病理過程中均可以向周圍細胞傳遞多種分子信號，此外，所有的真核細胞都可以將外泌體分泌到血液、母乳、腦脊液、腹水、尿液、精液和唾液等體液中發揮其生理或病理作用。

圖1 受體細胞攝取外泌體的方式Fig.1 Exosome uptake by recipient cells

癌變具有高度異質性，是多種基因和多種細胞因子共同參與的復雜動態過程，隨著外泌體等新介質的研究展開，對腫瘤發生的認識也在不斷深入[6]。腫瘤細胞來源的外泌體(tumor-derived exosomes， TDEs)通過傳遞不同類型的生物活性物質發揮調控腫瘤轉移前微環境、介導腫瘤細胞發生上皮細胞-間充質細胞轉化(epithelial-mesenchymal transition， EMT)、調控血管通透性及腫瘤細胞對遠處轉移病灶的選擇性等作用，進而介導癌細胞的遠處轉移及靶器官轉移特異性[1]。越來越多的人認為外泌體與區域癌化(field cancerization， FC)、信號傳遞、腫瘤相關成纖維細胞的生成、血管生成、免疫抑制和耐藥性等方面[7]密切相關。本文將圍繞上述幾個方面進行綜述，總結外泌體在癌癥發生發展過程中的作用。

1 外泌體與腫瘤發生

癌癥發生過程中，正常細胞逐步演變成惡性病變，這些病變最終會導致局部惡性腫瘤的發生，繼而發生遠處轉移。當細胞通過遺傳或散發性事件獲得癌癥驅動基因的轉化突變時，腫瘤就會發生[8]。大多數的癌癥是通過偶發事件發生的，通常是由于暴露在環境致癌物中或感染[9]，其中炎癥起重要作用。炎癥反應是一種保護性宿主反應，旨在啟動對損傷的修復或消除疾病的病因，急性和慢性炎癥都是已知的癌變前兆[10]，炎癥誘導癌變的機制之一是通過產生活性氧(reactive oxygen species， ROS)和活性氮(reactive nitrogen species， RNS) 破壞DNA，誘導細胞癌變，當機體被細菌或寄生蟲感染時，炎癥便會啟動，活化的中性粒細胞和巨噬細胞能夠通過激活NADPH氧化酶、黃嘌呤氧化酶、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase， iNOS)和髓過氧化物酶(myeloperoxidase， MPO)產生ROS和RNS。為了清除感染源，這些氧化劑會破壞核酸、蛋白質和脂質，進而導致基因突變和腫瘤發生。近年來，有證據表明外泌體參與炎癥相關消化系統腫瘤的發生發展，如結腸癌、肝細胞癌(hepatocellular carcinoma， HCC)、膽管癌和胃癌等。

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease， IBD)是一種與結腸癌風險增加相關的慢性自身免疫性疾病，IBD患者腸腔內有大量多形核中性粒細胞(polymorphonuclear neutrophil， PMN)浸潤，浸潤的PMN可以釋放MPO，導致ROS的生成，ROS可誘導基因毒性應激，導致單鏈或雙鏈斷裂，引起癌變[11]。宏蛋白質組學顯示在新發IBD患兒中，某些外泌體可通過分泌MPO參與結腸癌的發生[12]。

HCC是另一種通過肝纖維化和肝硬化發展而來的炎癥性癌癥。肝纖維化可由肝實質細胞持續損傷引起，常見病因有病毒性肝炎、酒精中毒等，這些因素觸發ROS的釋放和肝星狀細胞(hepatic stellate cells， HSCs)的激活導致肝纖維化[13]。小鼠巨噬細胞分泌的外泌體和人血漿外泌體中含有的NADPH氧化酶和細胞色素P450均可參與ROS的產生，增強肝星狀細胞的活化和膠原合成，導致肝纖維化，但具體機制尚不清楚[14]。外泌體miR-192是丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)誘導肝纖維化的關鍵調控因子之一，其可以通過外泌體從HCV復制的肝細胞轉移到造血干細胞中。miR-192通過TGF-β1上調造血干細胞中的纖維化標志物，激活造血干細胞，使其分泌炎癥細胞因子并上調纖維連接蛋白和膠原蛋白的基因表達，導致肝纖維化[15]。膽管細胞來源的外泌體也被證明介導長鏈非編碼RNA H19向肝細胞轉移，促進肝膽汁淤積和纖維化，這些分別與膽管癌和HCC的發生息息相關[16]。

2 外泌體與腫瘤進展

腫瘤進展用于描述惡性腫瘤發生局部或遠處轉移，轉移是惡性腫瘤的全身性疾病形式，腫瘤細胞與局部或遠處的微環境相互作用，導致繼發性惡性腫瘤生長。腫瘤微環境的改變在惡性腫瘤進展中發揮重要作用，其中免疫細胞組成失衡、成纖維細胞表型變化和內皮細胞的改變等都是惡性病變的特征[17]。EMT的誘導及其逆轉證明了癌癥進展過程中細胞具有可塑性，是腫瘤進展的關鍵步驟。EMT使上皮細胞獲得間充質特征，使它們能夠單獨遷移、滲出，在血液中存活，最終植入到遠處器官。相反，在轉移生長過程中，細胞通過間充質-上皮轉化(mesenchymal-epithelial transition， MET)恢復上皮特征并形成繼發性腫瘤，外泌體在其中起重要作用。此外，外泌體在FC、細胞間信號傳遞、腫瘤相關成纖維細胞的生成、血管生成、免疫抑制和治療耐藥性中的作用同樣促進腫瘤生長與轉移[18]。

2.1 外泌體與FC

有研究者在口咽癌周的上皮組織中注意到在發展為肉眼可見的惡性腫瘤之前，細胞經歷了一系列遺傳學的改變，轉化為組織學正常但遺傳學異常的癌前細胞，癌前細胞在組織中增殖積累，形成癌前區域，在致癌因素的持續作用下，某些癌前細胞進一步積累基因改變并最終轉化為組織學異常的惡性腫瘤細胞，這些改變多是由關鍵的癌癥相關基因突變引起，這些變化可能導致細胞增長速度加快、死亡率降低或免疫逃避增加，同時那些位于癌前區域的癌前細胞仍然存在，仍有可能轉化為癌。目前，FC被認為是多種癌癥發展的基礎，包括肺癌、結腸癌、皮膚癌、前列腺癌和膀胱癌等[19-20]。TDEs是引發和誘導腫瘤微環境中周圍細胞分子改變的積極參與者并促進多灶性腫瘤發生，最終導致FC。將健康細胞來源的外泌體和TDEs進行比較，證明了與健康細胞來源的外泌體相比，TDEs可以介導正常細胞癌變。來自亞砷酸鹽轉化的肝細胞外泌體circRNA-100284可以通過加速細胞周期和促進細胞增殖介導健康肝L-02細胞的惡性轉化，而來自正常細胞的外泌體沒有這種能力[21]。對比胰腺正常細胞，人類胰腺癌細胞外泌體在NIH-3T3細胞轉化中起到了啟動劑的作用。TDEs可將促瘤生物分子轉移到受體細胞，使信號通路異常激活并誘導突變，最終導致靶細胞發生不可逆的變化[22]。

2.2 外泌體與信號傳遞

腫瘤進展的另一種方式是以外泌體為載體向鄰近細胞傳遞旁分泌信號。Steenbeek等證實[23]來自侵襲性黑色素瘤的外泌體可顯著增強侵襲性較弱或轉移性較差癌細胞的增殖能力、侵襲潛能和EMT標志物的表達。卵巢癌細胞來源的外泌體傳遞旁分泌信號與化療耐藥性增加有關。缺氧介導的腫瘤進展在卵巢癌中很常見，Dorayappan等[24]發現與缺氧誘導的外泌體共同培養的癌細胞顯示順鉑外流，從而提高了癌細胞存活率。此外，使用抑制劑阿米洛利阻斷外泌體釋放的同時使用順鉑治療可導致卵巢癌細胞凋亡增加和增殖減少，故抑制癌細胞中調節外泌體分泌的蛋白可以限制TDEs傳遞旁分泌信號，以提高化學治療的有效率。

一項關于外泌體miR-93在HCC發生發展中的作用的研究顯示外泌體miR-93具有促進腫瘤細胞增殖和侵襲的能力，并表明外泌體miR-93過表達預示著HCC患者預后不良[25]。說明TDEs通過細胞間的信號傳導在介導腫瘤進展、轉移和化療耐藥方面的關鍵作用，并為改善臨床結局提供了靶點。

2.3 外泌體與腫瘤相關成纖維細胞

腫瘤細胞的轉移需要不同類型細胞之間的相互作用，而成纖維細胞向腫瘤相關成纖維細胞(tumor-associated fibroblasts， CAFs)轉化的激活在促進腫瘤生長和轉移中起著重要作用[1]，CAFs多通過細胞外基質重塑和生長因子信號傳導觸發EMT促進腫瘤轉移。膀胱癌細胞的外泌體TGFb介導成纖維細胞轉化為CAFs，而CAFs的條件培養基促進非侵襲性膀胱癌細胞的EMT、細胞生長、遷移和侵襲，由此形成惡性循環[26]。

腫瘤來源的外泌體miR-1247-3p通過下調其靶標B4GALT3介導成纖維細胞向CAFs的激活，進而激活β1-整合素-NF-κB途徑，促進肝癌的肺轉移[27]。此外，CAFs產生的外泌體miR-181d-5p促進EMT并對乳腺癌細胞凋亡有抑制作用[28]，來源于CAFs的外泌體也被證明通過激活TGF-β信號通路增加腫瘤細胞對放療的耐藥性，促進結直腸癌細胞的干細胞性[29]。揭示了CAFs相關的外泌體在促進腫瘤進展和通過宿主器官EMT促進轉移級聯方面的獨特功能。

2.4 外泌體與腫瘤血管生成

腫瘤的生長需要足夠的氧氣和營養來維持其微環境及轉移。外泌體通過轉運血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase， MMP)和microRNA等眾多促血管生成生物分子參與癌癥進展中的血管生成[30]。TDEs通過將胃癌細胞中的miR-130a或miR-155遞送到人內皮細胞促進血管生成[31]，TDEs可調節內皮細胞以刺激腫瘤血管生成。外泌體誘導的腫瘤細胞增殖導致氧氣和營養供應不足，使腫瘤微環境缺氧，進一步驅動EMT的發展，缺氧促進外泌體分泌增加，低氧外泌體的多種功能促進了腫瘤進展和轉移，與來自食管鱗狀細胞癌的正常氧外泌體相比，低氧外泌體被證明在體外和體內都能增強血管生成[32]。除此之外，Hoshino等[33]發現外泌體在遠處器官轉移前生態位的形成中也發揮重要作用。

2.5 外泌體與免疫抑制和耐藥

腫瘤細胞逃避免疫監視的能力已被認為是癌癥轉移的關鍵特征之一，并有助于產生耐藥性。腫瘤細胞可以通過分泌外泌體抑制免疫細胞功能和增殖，包括CD4+、CD8+T細胞、自然殺傷細胞(natural killer， NK)和巨噬細胞等[34-35]。Zhao等[36]發現胰腺癌細胞的TDEs顯著降低了兩種主要的細胞因子TNF-α和IFN-γ以及NK細胞的產生，削弱了NK細胞對腫瘤干細胞的細胞毒性，而腫瘤干細胞可能是導致腫瘤轉移和耐藥的原因之一。來自高轉移性乳腺癌細胞的外泌體直接抑制T細胞增殖并抑制NK細胞活性，進而抑制轉移前器官的抗癌免疫反應。巨噬細胞是非特異性免疫反應的關鍵參與者，在HCC微環境中十分重要[37]，腫瘤源性刺激作用于巨噬細胞，可以使其極化成經典(M1)或替代(M2)表型，M1巨噬細胞具有抗腫瘤活性，M2巨噬細胞具有促腫瘤活性，在HCC從早期向晚期發展過程中，腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages， TAMs)從M1型逐漸轉變為M2型[38-39]。體外實驗中，HCC來源的外泌體將長鏈非編碼RNA TUC339轉移至鄰近巨噬細胞，調節M1/M2極化，抑制抗腫瘤免疫應答，TUC339還參與細胞因子和趨化因子受體信號通路，進一步影響腫瘤免疫抑制和耐藥，加速HCC的進展，具體機制有待進一步闡明[40]。

靶向治療在乳腺癌治療中舉足輕重，曲妥珠單抗是首個被批準用于治療HER2+乳腺癌的單克隆HER2抗體，可顯著提高患者的無病生存率，但大多數患者在治療1年后就對HER2靶向藥物產生耐藥性。已有證據表明外泌體介導的抗體藥物中和作用參與乳腺癌患者曲妥珠單抗耐藥[41]。從SK-BR-3和BT-474乳腺癌細胞株分離的外泌體過表達HER2，可直接與曲妥珠單抗結合并在體外阻斷其活性。

3 外泌體與惡性腫瘤診斷

外泌體攜帶各種類型的物質，包括突變的DNA片段、RNA和與各種表型相關的蛋白質，并提供關于個體腫瘤狀態的大量信息，外泌體已經成為一種新的工具，用來隨訪癌癥發展。自從外泌體miRNA-21首次被發現作為癌癥診斷和預后的血清標志物以來，越來越多含有非編碼RNA的外泌體被廣泛研究，它們可以提供有效的診斷信息，并有助于監測癌癥進展。血清外泌體miR-301a是一種候選癌基因[42]，可作為神經膠質瘤的一種新的診斷和判斷預后的生物標志物。

通過對大量血清樣本的分析發現胰腺癌患者血清中外泌體glypican-1(GPC1)的水平明顯高于健康人[43]，這為外泌體監測早期胰腺癌提供了重要的依據，外泌體GPC1水平可能是一種極具價值的非侵襲性診斷和篩查工具。體內實驗表明，從血漿中分離出的循環外泌體DNA可用于鑒定親代腫瘤細胞的突變[44]，進而提供癌癥特異性突變信息。在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer， NSCLC)的診斷中，EGFRT790M突變是一個關鍵的生物標志物[45]。此外，血漿外泌體中攜帶的MiR-451a是一種新型的生物標志物，可用于預測NSCLC患者根治性切除術后的復發和預后[46]。

4 外泌體作為藥物載體參與治療

外泌體作為一種內源性、膜透性的載體，可將核酸和蛋白質等活性大分子轉移到受體細胞內進行細胞間信息交換[47]。外泌體可以直接接觸靶細胞胞膜并融合釋放內容物或通過內吞作用被靶細胞攝取，還可以通過識別細胞表面受體傳遞信息。一旦外泌體進入受體細胞，它們的內容物就被釋放出來，其中的成分可以驅動各種生物過程的變化，包括基因表達、免疫反應和信號轉導[48]。

臨床實踐中，為了提高腫瘤治療的有效性，迫切需要將藥物精確地遞送到腫瘤細胞，與其他材料相比，外泌體可被細胞吸收，并能穩定地轉運藥物，可以克服生物利用度差的缺點，降低非靶向細胞毒性和免疫原性，故外泌體具有作為腫瘤免疫治療藥物和疫苗載體的優勢[49]。Naseri等[50]利用從骨髓間充質干細胞中分離出來的外泌體運載LNA(鎖定核酸)修飾的抗miR-142-3p寡核苷酸，抑制4T1和TUBO乳腺癌細胞系中miR-1423p和miR-150的表達水平，減少腫瘤細胞增殖，并證實這種外泌體是合適的納米級載藥載體，能將寡核苷酸導入腫瘤組織以發揮作用。Aqil等[51]證實與游離姜黃素相比，口服外泌體姜黃素增強了抗增殖、抗炎和抗腫瘤的活性。一些多肽、非編碼RNA或化療藥物可以通過不同的途徑加入外泌體中，以發揮更好的抗腫瘤作用，這使外泌體成為增強抗腫瘤治療和逆轉耐藥性的有效載體。

化學治療是腫瘤治療的基石，利用外泌體運載化療藥物開始應用在癌癥治療中。對于阿霉素與外泌體的結合研究較多，含阿霉素的外泌體被用于多種癌癥的治療，包括乳腺癌、肺癌、結腸癌和胰腺癌[52]。在結腸癌小鼠模型中，阿霉素負載的外泌體可使腫瘤體積減小，在小鼠炎性腫瘤模型中，含有阿霉素的外泌體具有有效的抗腫瘤作用。同時，負載阿霉素的外泌體在治療乳腺癌方面也表現出很好的效果。

隨著研究的不斷深入，可以充分利用外泌體作為自然載體的優勢，外泌體相關的癌癥治療將會取得巨大突破，使廣大癌癥患者受益。

5 展 望

外泌體具有高度異質性，包含與細胞起源相關的分子標記物，從癌癥患者體液中分離出來的外泌體已被證明含有癌癥特異性物質，可以反映細胞或組織狀態的改變，可作為實時監測腫瘤負荷和治療效果的生物標志物。同時，外泌體已被證明在腫瘤的起始和進展過程中發揮重要作用，盡管這些過程錯綜復雜，但隨著外泌體等新介質及其作用的闡明，人們對腫瘤發生發展的理解將更加透徹。

外泌體參與許多病理生理過程并能穩定地轉運藥物，克服了生物利用度差的缺點，降低非靶向細胞毒性和免疫原性，故外泌體具有作為腫瘤免疫治療藥物和疫苗載體的優勢。近年來，將功能性蛋白質、miRNA和各種化療藥物等加入外泌體中用于治療腫瘤的研究受到了推動，但目前以外泌體為基礎的癌癥治療策略仍有很長的路要走。了解TDEs在促進腫瘤生長、侵襲、血管生成、EMT和耐藥性中發揮的作用為更好的認識癌癥開辟了新思路，為減緩癌癥進展和轉移提供了治療手段，同時應運而生的新療法為腫瘤患者帶來了新的希望，相信隨著科學的發展，外泌體會在臨床疾病尤其是惡性腫瘤的診療中得到更加廣泛的應用。