急性肺損傷鼠類模型的研究進展

姚安潔， 饒晗鈺， 王冰冰， 王昌惠， 謝栓栓

(1. 同濟大學附屬第十人民醫院呼吸與危重癥醫學科，上海 200072； 2. 同濟大學醫學院，上海 200092)

急性呼吸窘迫綜合征是導致急性呼吸衰竭的重要原因之一，特點是頑固性低氧血癥和進行性呼吸窘迫，其主要臨床表現包括急性或進展性呼吸困難，以及胸部X線和CT顯示雙肺浸潤[1]。在全球，急性呼吸窘迫綜合征患者約占重癥監護病房入院人數的10%，每年約有超過300萬名患者，重癥者死亡率甚至高達46%[2-3]。因此，迫切需要建立合適的急性肺損傷動物模型來研究其發病機制。而小鼠和大鼠因其因易操作，繁殖快，相關性好等優點，成為研究急性肺損傷最常用的實驗動物[4]。本綜述主要是闡述急性肺損傷不同鼠類模型的優缺點，并就未來研究中如何完善動物模型提出建議。

1 急性肺損傷動物種類的選擇

急性呼吸窘迫綜合征的發病機制很復雜，各種致病因子和炎癥介質通過損傷肺泡上皮和毛細血管內皮細胞引起肺水腫和透明膜形成，從而使肺泡通氣血流比例失調，導致Ⅰ型甚至Ⅱ型呼吸衰竭[5]。鼠類的呼吸道結構不僅與人類有許多相關之處，能更好的模擬急性肺損傷的病理生理變化，而且容易敲除基因，能更有針對性地研究急性呼吸窘迫綜合征的發病機制[6]。免疫缺陷鼠需要在無特定病原級條件下飼養，實驗方法多樣，常見的包括CD-1小鼠、C57BL/6小鼠、Balb/c小鼠、C3H/HeN小鼠、DBA/2J小鼠和Sprague-Dawley大鼠等。其中小鼠中最常用的是C57BL/6小鼠和Balb/c小鼠，大鼠中最常用的是Sprague-Dawley大鼠，以下主要介紹這3種最常用的轉基因鼠類模型。

1.1 C57BL/6小鼠

此類小鼠于1921年由Lathrop小鼠近交培育得到的C57BL小鼠的第六組系，特點是品系穩定且易于繁殖，也是第一個完成基因組測序的小鼠品系，故常用于構建遺傳背景較為穩定的轉基因動物模型。該鼠乳腺癌發病率較低，有眼睛缺損，對放射性有抵抗力，對結核桿菌敏感，對鼠痘病毒有一定的抵抗力，干擾素產量高，對百日咳易感因子敏感。在研究急性肺損傷的發病機制時，因其能較好地展現肺損傷時機體炎癥反應的變化，常用于構建內毒素肺損傷模型，高氧暴露肺損傷模型，博來霉素肺損傷模型，病原體肺損傷模型，缺血再灌注肺損傷模型，盲腸結扎或穿刺肺損傷模型以及其他二次打擊肺損傷模型等。

1.2 Balb/c小鼠

此類小鼠于1932年由白化小鼠近交得到。特點是乳腺腫瘤自然發生率低，但用乳腺腫瘤病毒誘發時發病率高;卵巢、腎上腺和肺的腫瘤也有一定的發生率。易發生呼吸系統疾病相關的感染，對放射線敏感，有自發性高血壓和動脈硬化癥，對脂多糖較敏感，廣泛用于免疫學、腫瘤學等病理生理的研究。在研究急性肺損傷的發病機制時，因其也能較好地展現炎癥反應的變化過程，故也常用于構建所有適合C57BL/6小鼠的肺損傷模型，但不如C57BL/6小鼠常用。

1.3 Sprague-Dawley大鼠(SD大鼠)

此類大鼠于1925年由Wistar大鼠近親培育而成，但發育更快，且自發性腫瘤的發生率較低。該鼠對性激素敏感，對呼吸道疾病有較強的抵抗力，故常用于營養學，內分泌學和毒理學研究。在研究急性肺損傷的發病機制時，因其能更直觀清楚地展現肺通氣功能的變化，故常用于構建一些同樣適用于兔，犬，豬，羊等大型實驗動物的肺損傷模型，比如油酸吸入肺損傷模型，鹽水灌洗肺損傷模型，機械通氣肺損傷模型等。

2 急性肺損傷動物模型的特點

嚙齒類動物是應用最廣泛的急性肺損傷動物模型，但是由于不同物種間的先天性差異，造成了模擬急性肺損傷過程中的差異，所以在從動物實驗轉向臨床研究應用時要充分考慮這些差異。

2.1 Toll樣受體的物種差異

人類的白細胞通過Toll樣受體(toll-likere-ceptors， TLR)來識別微生物尤其是脂多糖，而小鼠的Toll樣受體4(TLR4)識別的是與人類不同的脂多糖結構。人類與小鼠的TLR4中?；湹目臻g結構以及飽和度都不同，故引起的炎癥反應也不同[7]。因此，在設計急性肺損傷動物模型時應考慮此物種差異。

2.2 單核吞噬細胞系統的物種差異

單核巨噬細胞系統(mononuclear phagocyte system， MPS)由巨噬細胞及其前體細胞組成，人類的肺毛細血管內皮細胞上附有肺血管內巨噬細胞(pulmonary intravascular macrophages， PIM)，能與微生物及其產物結合并局限在肺中。而小鼠和大鼠缺少PIM，其血管內的巨噬細胞及其結合的微生物主要局限在肝和脾中[8]。因此，動物對于肺損傷的反應不如人類敏感。

2.3 一氧化氮的物種差異

研究表明，一氧化氮(nitric oxide， NO)參與肺損傷的發病機制。人類的巨噬細胞非激活狀態下產生的NO很少，而大鼠和小鼠的肺泡巨噬細胞能產生大量的NO，這是由于兩者可誘導的NO激酶的作用與活性NO的含量不同[9]。

2.4 趨化因子和趨化因子受體的物種差異

人類免疫系統中的白細胞介素-8(interleukin 8， IL-8)，在急性肺損傷的過程中能招募中性粒細胞到特定部位。大鼠和小鼠無IL-8，但可以產生IL-9和IL-10，吸引漿細胞樣樹突細胞至肺，在增強中性粒細胞的防御功能中起到了關鍵的作用[10]。

由于以上物種差異的存在，因此必須非常重視從動物實驗到人體試驗的轉化過程，比如動物模型所證實的發現應該在一種以上的大型哺乳動物中也得到證實才能外推到人體試驗，還應特別關注并比較不同物種試驗過程中能反映肺泡毛細血管通透性和炎癥反應變化的具體測量數值，而且進行人體試驗時的劑量和措施也應該更加謹慎等。

3 急性肺損傷動物模型的構建

急性肺損傷的動物模型是基于與人類呼吸窘迫綜合征相關的一些臨床疾病構建的，比如細菌感染、缺血再灌注損傷、創傷、腹膜炎等疾病，其中高潮氣量或高峰值吸氣壓力的機械通氣、肺部或全身內毒素給藥以及盲腸結扎后穿刺法都是最常用的動物肺損傷模型。此外聯合不同的模型還可以構建二次打擊模型，如使用鹽水灌洗或脂多糖氣管內滴注后繼以機械通氣、盲腸結扎穿刺繼以出血，或腹膜炎繼以腸道缺血再灌注損傷，氣管內先后滴注鹽酸和內毒素等[11]。以下將從組織學分類，介紹基于肺毛細血管內皮細胞損傷、肺泡上皮損傷或兩種損傷均有的各種肺損傷模型，見表1。

表1 不同急性肺損傷模型的對比

3.1 以肺毛細血管內皮細胞損傷為主的模型

3.1.1 內毒素 內毒素，又叫脂多糖(lipppolysa-ccharide， LPS)，是存在于革蘭陰性菌外膜中的糖脂，能與血清中特定的LPS結合蛋白結合并激活單核細胞、巨噬細胞等其他細胞上的TLR4受體，進而介導炎癥反應。

脂多糖模型有氣管滴注法和靜脈注射法。Yang等[12]以成年雄性C57BL/6小鼠為實驗對象，通過氣管內滴注溶解在50 μL無菌鹽水中的LPS(5 mg/kg，來自大腸桿菌O111： B4)來構建急性肺損傷模型。LPS滴注后每6 h計算一次存活率；LPS注射后12 h處死小鼠，將致死劑量的LPS(25 mg/kg)注射到氣管中用于生存研究。Gong等[13]將10周齡雄性BALB/c小鼠氣管插管后，滴注LPS(3 mg/kg，來自大腸桿菌血清型O55： B5)。也有將脂多糖模型應用到大鼠模型中的實驗。Wu等[14]以雄性Sprague-Dawley大鼠為實驗對象，尾靜脈注射0.5 mg/kg LPS生理鹽水，注射體積為0.2 mL(LPS： 1 mg/mL)。

脂多糖模型可重復性好，易于操作，更有利于研究細菌感染引起的炎癥反應；但是容易被污染，且引起的內皮損傷可能不明顯。

3.1.2 油酸 油酸(oleic acid， OA)模型可以模擬由脂質栓塞引起的急性呼吸窘迫綜合征，脂肪酸直接作用于肺毛細血管內皮細胞并觸發免疫系統的激活，最終導致細胞損傷。

動物模型通常為大鼠，通過注射鹽形式的油酸來避免血液乳化的不良影響。Tian等[15]將雄性Sprague-Dawley大鼠靜脈注射OA的鹽溶液(1 mL鹽水中加入0.4 mmol/kg的OA)，對照組則注射1 mL/kg 的生理鹽水。注射OA后30 min內就會迅速造成內皮細胞損傷，進而導致肺部斑片狀炎癥，肺泡滲透性增加和氣體交換障礙[16]。

油酸模型的優點是具有可重復性和快速起效性，但是可能不適合研究膿毒癥所致的急性呼吸窘迫綜合征，也不適合研究通過改變炎癥反應以降低肺損傷程度的治療方案。

3.2 以肺泡上皮細胞損傷為主的模型

3.2.1 吸入酸 胃內容物吸入后可能會導致吸入性肺炎，嚴重者進展至急性呼吸窘迫綜合征，因此研究中常用鹽酸(hydrochloric acid， HCl)來模擬胃酸吸入引起的肺損傷。

Kral-Pointner等[17]以C57BL/6J小鼠為研究對象，麻醉之后用鹽酸(50 μL，濃度為0.1 mol/L)行氣管內滴注以誘導急性肺損傷，之后用磷酸鹽緩沖液灌洗得到支氣管肺泡灌洗液，待動物死亡后取肺組織進行下一步研究。

吸入性肺炎能導致遠處器官的中性粒細胞依賴性損傷，因此有利于研究急性呼吸窘迫綜合征中性粒細胞炎癥反應機制。但是要區別的是，有害酸和無害酸濃度之間的差異非常小，而且人類不吸入單純的HCl，而是吸入由顆粒物質、細菌產物、細胞因子和胃酸等復雜成分構成的胃內容物。

3.2.2 高氧 人類暴露在高濃度氧氣中長達3 d也不會導致肺損傷，但是大多數哺乳動物暴露于高氧中會導致呼吸窘迫和死亡，是因為高氧可能通過活性氧或者與NO相互作用來加重急性肺損傷的程度。

為了構建高氧造成的急性肺損傷模型，Guo等[18]將C57BL/6J小鼠在出生后第1天到第7天或第1天到第14天連續暴露于室內空氣(21%O2)或高濃度氧氣室(85%O2)中，而且要在常氧和高氧條件之間切換24 h以避免氧中毒。

高氧模型可導致明顯的肺部滲出變化，但是與人類疾病的相關性尚不明確，而且需要專門的設備和知識來保證輸送足夠濃度的氧氣，故不常用。

3.2.3 鹽水灌洗 當用生理鹽水反復灌洗肺后，肺泡表面活性物質會迅速耗竭導致肺泡壁塌陷，之后再進行大容量機械通氣且無正壓通氣時，就會造成一種類似于人類急性呼吸窘迫綜合征的肺損傷。鹽水灌洗模型通常用于兔子，豬等大型實驗動物中，但也見于大鼠中，且后續通常需要增加如內毒素滴注或機械通氣等二次損傷操作。

Kuethe等[19]將雄性Sprague-Dawley大鼠用10 mL/kg的生理鹽水進行2次鹽水灌洗，然后用注射器回收肺部的液體和泡沫，1 h后可得到明顯的肺部滲出的影像結果。

鹽水灌洗模型提供了一種理想的方法來研究不同機械通氣策略對急性肺損傷發展的影響，但是實驗操作復雜，而且不適合模擬急性呼吸窘迫綜合征的初始病理生理機制。

3.2.4 機械通氣 機械通氣可以直接導致肺損傷，也可以出現在急性呼吸窘迫綜合征的治療過程中，因此可以模擬出對患者生存影響最大的臨床情況。機械通氣模型的實驗對象通常是大鼠或者更大型的實驗動物，如兔、豬、羊等。

Katira等[20]以成年雄性S-D大鼠為實驗對象，先構建膿毒血癥模型，然后建立靜脈通路、氣管切開和頸動脈插管并維持麻醉，設置好標準后(潮氣量： 6 mL/kg；呼吸頻率： 60/min；氧濃度： 21%；呼氣末正壓： 3 cmH2O)進行通氣并記錄參數。穩定后，將動物隨機分配成為以下組別，即氣道壓力分別為14、30、45 cmH2O，機械通氣1 h直至死亡。

機械通氣模型的優點是具有相當大的臨床意義，缺點是操作復雜，而且動物與人類的機械通氣時間也是不同的，有待在未來進一步研究。

3.2.5 博來霉素 博來霉素是一種從放線菌和鏈霉菌中分離出來的毒素，主要導致肺纖維化，通常用于研究急性肺損傷早期纖維化愈合的過程。博來霉素通常采用氣管滴注法。

Cui等[21]以雄性C57BL/6小鼠為研究對象，麻醉后在頸部氣管行垂直，再使用胰島素注射器，將250 μL硫酸博來霉素的鹽溶液(0.5 U/kg或1 U/kg)注入氣管，手術閉合切口，構建博來霉素動物模型。

博來霉素模型易操作，可重復性好，但是不易形成透明膜，刺激性過強故與臨床的關系可能缺乏確切的依據。

3.3 肺毛細血管內皮細胞和肺泡上皮損傷均有的模型

3.3.1 病原體 病原體法是將不同的細菌，真菌或者病毒通過鼻內或者氣管滴注給動物，從而構建不同的急性肺損傷模型。常用的病原體包括銅綠假單胞菌、大腸桿菌、肺炎鏈球菌、白念珠菌，呼吸道相關病毒等。其中銅綠假單胞菌是導致重癥監護病房里呼吸機相關性肺炎的主要病原體[22]，大腸桿菌是導致膿毒血癥的重要病原體[23]。

Faure等[24]以C57BL/6小鼠為研究對象，鼻內滴注50 μL含銅綠假單胞菌的細菌溶液(1×107CFU，2×107CFU或1×108CFU菌株)，24 h后處死小鼠；Li等[25]以Balb/c小鼠為研究對象，氣管內注射100 μL含白念珠菌的細菌溶液(1×107CFU菌株)，治療后48 h吸入CO安樂死；Leist等[26]用以上兩種小鼠為研究對象，先通過連續傳代得到一種含有重組小鼠易感染的新冠病毒SARS-CoV-2 MA10的細胞，再通過鼻內滴注105CFU此細胞和不同劑量的稀釋在緩沖液中的此細胞來感染小鼠，最終經過實驗發現C57BL/6小鼠的感染癥狀比Balb/c小鼠輕[26]。

此類模型易操作，但要根據每種病原體的不同特點和研究的目的方向來選擇合適的動物模型。

3.3.2 煙霧損傷 長期吸煙是造成慢性阻塞性肺病的重要誘因，但香煙等有害煙霧也可能造成急性肺損傷。

比如，Dong等[27]以Balb/c小鼠為研究對象，將其暴露在有一定濃度的特定香煙煙霧的通風室，每天連續3次，每次2 h用完3支特定香煙每周5 d，連續2周，以構建香煙煙霧引起的急性肺損傷動物模型。

此類模型有助于研究慢性阻塞性肺疾病中發生急性肺損傷的病理生理機制，進而更好地研究此類疾病整體的發病機制。

3.3.3 缺血再灌注損傷 在肺部或遠處血管中缺血后再灌注(ischemia/reperfusion， I/R)可導致肺損傷，通常見于肺移植后的肺損傷。大鼠常用于構建除肺部以外的遠處器官血管的缺血再灌注損傷模型。

此類模型可以研究人類外周器官缺血再灌注后肺損傷的發病機制，但是此過程中肺部損傷往往是輕微的，需要繼發性刺激(如LPS)才能引起顯著的肺損傷，故通常會構建二次打擊模型。

3.3.4 膿毒血癥 臨床上，許多患者在腹膜炎發生后繼發膿毒血癥，進而導致急性呼吸窘迫綜合征。誘導膿毒血癥的實驗方法主要有活細菌法、盲腸結扎和穿刺法(cecum ligation and puncture， CLP)，以及內毒素法。與活細菌法和脂多糖法相比，盲腸結扎和穿刺法見效快，持續時間長，且進行性發作，因而是更常用的急性肺損傷動物模型。

Chen[29]以雄性C57BL/6小鼠為實驗對象，麻醉小鼠后腹部切開暴露盲腸，剝離腸系膜后在盲腸末端用4號線結扎盲腸。接著用21號無菌針在結扎遠端1 cm處進行盲腸穿刺，最后進行傷口縫合。使用1 mL預熱的生理鹽水(37 ℃)用于小鼠液體復蘇，每6 h皮下注射1次丁丙諾啡用于鎮痛。

CLP可能是研究膿毒癥和器官損傷的單一最佳動物模型，但是肺內炎癥和透明膜形成不太明顯，而且手術復雜，而且實際菌群未知，造成的影響也未知。

4 急性肺損傷動物模型的評價方法

不論是在臨床中的人類急性呼吸窘迫綜合征，還是在動物實驗模擬的急性肺損傷，都有以下4個方面的特征表現： 組織學損傷，肺泡毛細血管屏障損傷，炎癥反應和生理功能障礙。動物實驗需要至少3個方面發生改變才能證明急性肺損傷模型已經成功構建，而隨著動物實驗轉化為臨床前藥物試驗甚至至臨床實踐研究，則至少需要4個方面均發生改變，并且每個方面至少要有1種測量方法來評價變化。

4.1 組織損傷評價

組織學變化是急性肺損傷最相關的特征，主要包括： 肺泡腔充滿肺泡液和細胞碎片，肺泡上皮細胞損傷，中性粒細胞浸潤，肺泡間隔增厚以及透明膜出現。

通常在動物死亡后將肺組織切片進行蘇木精-伊紅染色，然后在顯微鏡下觀察病理組織變化，此方法操作簡便。雖然某些急性肺損傷模型可能需要特定的組織學評價標準[30-31]，但是仍然需要一個相對統一和可靠的組織學評分標準以及計算機系統，以廣泛應用于急性肺損傷研究中。

4.2 屏障損傷評價

肺泡-毛細血管屏障破壞是急性肺損傷的重要特征，會導致富含蛋白質的液體充滿肺泡腔，故支氣管肺泡灌洗液中白蛋白等其他循環蛋白的含量增高，肺濕干比增加，肺血管通透系數增加。主要分為肺泡-毛細血管通透性增加的測量，和血管外肺水增加的測量。評價肺泡-毛細血管屏障的損傷程度，通常的方法是用伊萬斯藍染料作示蹤劑，它可以與白蛋白緊密結合，從而反映滲入肺泡腔中的蛋白液的含量。測定血管外肺水含量最準確的方法是重量法，測量死亡后的肺組織重量即濕重，烘干后再測量即干重，兩者相比為干濕比。目前還探索了其他方法，比如熱稀釋技術[32]，電阻抗斷層掃描技術等[33]，不如重量法準確但是無創，有望改進后在未來應用于臨床。

4.3 炎癥反應評價

炎癥反應是急性肺損傷過程中另一項重要的特征，主要包括： 趨化因子或細胞因子增加，中性粒細胞數量增加，單核-巨噬細胞和淋巴細胞亞群增加。常見的細胞因子包括IL-6、IL-1β、IL-18、IL-10等，有助于更有針對性地研究急性肺損傷的發病機制。中性粒細胞數量的增加可以通過測定支氣管肺泡灌洗液里的中性粒細胞彈性酶或髓過氧化物酶的含量或活性來反映。通常采用蛋白質印跡法，酶聯免疫吸附法，蛋白質電泳或流式細胞儀等方法來測定上清液中酶的含量。但是需要注意的是，測量酶的水平與活性是有區別的，酶的水平可以反映中性粒細胞的數量，而酶的活性代表了活化細胞釋放的酶的蛋白水解作用[34]。此外在不同的急性肺損傷模型中，炎癥反應的細胞可能不止中性粒細胞，故對單核細胞- 巨噬細胞和淋巴細胞亞群的測定是一種補充[35]。測定炎癥反應，其優點是便于研究具體病理生理機制，缺點是可能不具有明顯的急性肺損傷特征性。

4.4 生理功能障礙評價

與肺部生理功能障礙最相關的方面是動脈血氣測量，其次是肺順應性和彈性的變化，和肺泡液的清除率。小型動物需要特定的血氣分析儀或者脈搏血氧儀來分析血氣，但受到實驗室條件的限制往往不常用。肺順應性的變化包括死腔量、氣道阻力，肺阻力，肺總量，吸氣末肺容量，和肺不張的變化等，可以通過強制振蕩技術來測量，但也不常用[36]。相對常用的方法是測定肺泡液清除率，可以用通過單指示劑或雙指示劑稀釋技術來測量[37]。需要注意的是，臨床上急性呼吸窘迫綜合征的生理功能障礙主要表現在影像學中，故目前正在開展針對小型動物的成像技術的研究，包括微型計算機斷層掃描，小動物磁共振成像，小動物肺部超聲等[38]。

5 急性肺損傷動物模型的應用

因為動物模型可在一定程度上模擬急性呼吸窘迫綜合征患者的肺部環境，所以可以用于研究改善臨床上原有的治療方案。比如，Monsel等[39]發現靜脈輸注人臍帶來源的間充質基質細胞可能有助于改善新冠肺炎引起的早期急性呼吸窘迫綜合征。Adrover等[40]發現雙硫侖不僅可以用于醒酒，還可能通過阻止中性粒細胞胞外誘捕網的形成來有效抑制重癥新冠肺炎患者在急性肺損傷時期的肺部炎癥級聯反應。這些關于急性呼吸窘迫綜合征的研究和發現，都能為未來在不同領域探索新的治療方向作出貢獻。

6 展 望

本文探討了不同免疫缺陷鼠的特點，介紹了多種急性肺損傷模型的建立方法及其評價方法。進行急性肺損傷實驗時，應根據研究目的，實驗條件以及模型特點來選擇合適的建模方式和評價方法?？偠灾?，動物模型是研究的基礎，也是后續評估急性肺損傷的動力學、放射學、生理學以及組織學等方面的關鍵，因此建立合適的動物模型對于研究急性呼吸窘迫綜合征的發病機制具有重要意義。在設計實驗時，必須仔細考慮動物模型的目的性和局限性，這樣才有可能在未來進一步改善細菌，病毒感染等各種機制導致的急性呼吸窘迫綜合征患者的臨床治療策略。