晶狀體類器官培養技術的發展與挑戰

傅秋黎 姚克

浙江大學眼科醫院 浙江大學醫學院附屬第二醫院眼科中心，杭州 310009

白內障是由老化、遺傳、外傷等各種原因引起的晶狀體蛋白變性聚集、晶狀體混濁而導致視力障礙的眼科疾病，也是全球首要的致盲眼病。目前，利用人類晶狀體上皮細胞(lens epithelial cells，LECs)構建的二維模型是研究白內障最常用的體外模型。近年來隨著干細胞技術和再生醫學的突飛猛進，利用干細胞培養類器官進而構建疾病模型已成為兼具科研價值與臨床前景的研究熱點，在2021年類器官更是被列為“十四五”國家重點研發計劃重點專項。類器官是在體外培養構建的與人體組織器官具有一致的宏觀及微觀三維結構，甚至具備相應生理功能的簡化版器官，其可以模擬體內真實器官的結構與功能，為精準醫療提供了全新的研究方法與治療手段。類器官的培養一般來源于組織中的成體干細胞，或是具有廣泛分化潛能的多能干細胞(pluripotent stem cells，PSCs)，PSCs又包括胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)和誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)。這些具備自我更新和定向分化能力的細胞可以在特定的培養條件下自我生長并組裝成具有精密排列規律和空間結構的類器官。長期以來，研究者在不斷探索的過程中已通過不同細胞來源和培養方法成功于體外構建出多種再生晶狀體，也稱為晶狀體小體(lentoid bodies，LBs)。

1 干細胞在晶狀體再生中的作用

研究者們最早觀察到的晶狀體再生現象來自于以蠑螈為代表的低等兩棲動物。蠑螈可以在晶狀體摘除后通過背側虹膜色素上皮細胞的轉分化實現晶狀體的再生，這一過程也可以通過體外培養蠑螈虹膜色素上皮細胞實現。不同于具備強大再生能力的兩棲動物，目前發現的哺乳動物中晶狀體的再生現象均依賴于結構相對健全、完整、無粘連折疊的晶狀體囊膜，這是由于晶狀體的前囊膜及赤道部囊膜上排布的LECs中夾雜有可以定向分化為LECs的成體干細胞，即晶狀體干細胞。早期研究發現在摘除兔、小鼠和大鼠的晶狀體后，囊膜上殘留的晶狀體干細胞均可生長出晶狀體樣組織，但其完整性和透明性欠佳。而在體外培養兔、小鼠以及人類LECs的過程中也可通過與晶狀體囊膜、玻璃體、睫狀體中成纖維細胞的共培養得到具有三維結構的晶狀體樣組織，并且其中一些已經擁有一定的透明性及光學特性，且可從中檢測到包括αA、αB、β和γ-crystallin在內的多種晶狀體特異性標志物。此后我國中山眼科中心研究團隊為了盡可能保存晶狀體囊膜上具有再生潛力的干細胞，縮小了撕囊口并將其移至囊膜周邊部，采用該術式吸除晶狀體的兔、食蟹猴甚至是兒童白內障患者均實現了術后透明晶狀體組織的再生，雖然該方法并不適用于細胞增生水平較弱的成年個體以及存在遺傳突變的先天性白內障患兒，距離臨床應用還有很多亟待解決的問題，但其有力地印證了存在大量具備強大增生潛能的干細胞是實現晶狀體再生的首要生物學基礎。

2 利用PSCs體外構建LBs

相較于只能定向分化且難以從體內分離獲取的晶狀體干細胞，人源性ESCs和iPSCs具有在體外無限增生、可分化為三胚層中不同組織細胞的能力，目前被廣泛應用于各發育時期各類細胞的分化培養以及三維類器官的體外構建。在眼科領域，利用PSCs在體外培養視網膜類器官和角膜類器官已經初步實現，其中角膜類器官具有角膜發育中同樣的特征并表現為上皮、基質和內皮3層結構；視網膜類器官在誘導分化過程中經歷了胚胎眼發育的各階段，擁有視網膜組織中所有細胞類型并可呈現分層結構。2010年，Yang等通過調控在晶狀體發育過程中極為重要的成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，FGF)、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)和Wnt通路，創建了三階段培養法，開創性地將人ESCs分化培養為具有三維結構的LBs，該方法也成為未來晶狀體體外培養新方法衍生迭代的技術基礎。隨后Qiu等于2012年將年齡相關性白內障患者的LECs重編程去分化為iPSCs，并在體外經過三階段培養將其誘導為LBs，為人類自體來源的iPSCs體外誘導LBs開創了先河。本研究團隊于2017年探索出一種晶狀體類器官構建新方法——“荷包蛋法”，將人尿源性誘導多能干細胞(urinary human induced pluripotent stem cells，UiPSCs)通過三階段培養，早期機械篩選，在分化過程中出現“荷包蛋樣”細胞結構，最終在第25天時發育為成熟透明的LBs。該再生晶狀體直徑已達到目前已知最大的3 mm，包含正常晶狀體擁有的所有結構，同時可以實現1.73倍左右的放大率。而Murphy等在分化過程中通過識別LECs的特異性抗原對細胞進行篩選，為LBs的體外大規模構建提供了一種簡單有效的方法。2020年，Ali等借助“荷包蛋法”將人外周血單核細胞來源的iPSCs培養成LBs，并通過對人ESCs和iPSCs來源的LBs轉錄組和蛋白質組進行分析，發現兩者表達譜系高度重疊且與正常晶狀體一致，證明2種干細胞來源的再生晶狀體誘導方法等效且可靠，展現出良好的應用前景。

3 利用晶狀體類器官構建體外研究模型

人晶狀體類器官的體外誘導過程模擬了人胚胎晶狀體的發育歷程，在分化過程中相應時間可檢測到與發育過程一致的特異性晶狀體基板標志物、早期晶狀體標志物和纖維細胞標志物的表達。本研究團隊在通過“荷包蛋法”誘導LBs的過程中發現一長鏈非編碼RNA：lncRNA ALB，它可以通過調節自噬標記物LC3B活化而調控自噬過程，影響細胞核、細胞器的退化及代謝廢物的及時清除，從而在人晶狀體正常發育過程及透明性維持中發揮作用?？紤]到LBs誘導分化的過程本身即可作為一個發育學模型，我們相信未來大量關于晶狀體發育機制的基礎研究可以借助于該體外模型相對便捷而直觀地開展。

穩定可靠的疾病模型是研究白內障發病機制、病理生理特點及治療手段的必要基礎。本研究團隊已經利用UiPSCs來源的LBs構建出包括年齡相關性白內障和先天性白內障在內的體外疾病模型。本研究團隊發現LBs培養成熟后會隨著時間推移逐漸喪失透明性，并且這一混濁過程會因過氧化氫暴露而加速，同時還從中檢測到了白內障進展過程中至關重要的晶狀體蛋白聚集以及自噬活性的改變，這表明本研究團隊借助過氧化氫氧化處理LBs，在世界上首次體外構建了人源性年齡相關性白內障疾病模型。同時為了構建先天性白內障體外模型，本研究團隊將2個帶有不同先天性白內障基因突變遺傳家系的UiPSCs誘導分化成LBs，發現患者來源的LBs均出現明顯混濁，且其混濁程度和形態特征與患者白內障的外觀和分型高度一致，LBs分化過程也與患者的病程特征十分相似，這表明本研究團隊首次構建出了可高度反映患者遺傳背景與疾病特征的先天性白內障體外模型。

體外疾病模型的建立不僅會推動白內障病理機制研究的進一步發展，還可以為白內障的藥物研發和篩選提供可靠的實驗平臺。目前包括羊毛甾醇在內的化合物已被報道可以在二維細胞模型和動物模型上通過阻止晶狀體蛋白異常聚集發揮療效；但這些藥物的穩定性和有效性仍需更可靠的人源性疾病模型驗證，研究者若能借助LBs白內障體外模型篩選出具有明確療效的白內障新藥，將大大有助于降低診療費用、提供早期治療機會、避免手術創傷和并發癥，切實地造福于患者。

將LBs作為白內障致病機制研究和候選藥物評估的體外模型，相對于以往傳統的細胞和動物模型而言具有不可替代的優勢：相較于氧化性藥物和紫外線輻照誘導的白內障動物模型可以避免全身毒性的干擾以及物種異質性的影響；相較于人LECs細胞模型可以模擬人類晶狀體的形態結構特征和微環境中各組分的相互作用，從而獲得更真實、更接近在體狀態的實驗結果。我們期待更多的中國研究者可以借助先進的LBs模型開展實驗，以期進一步探明白內障的發病機制及藥物靶點。

4 展望

白內障的發病機制十分復雜，藥物研發也仍存在很大的空白，未來，我國的眼科研究者需要在加深對人晶狀體發育和再生的分子機制認識的基礎上不懈推進LBs構建方法的演進和迭代。正常成年人類晶狀體的直徑為9 mm，目前培養出最大的LBs的直徑僅為3 mm。因此提升LBs相對于正常晶狀體形態和功能的一致性仍是下一階段研究的重要任務。另一方面，隨著再生醫學和干細胞療法的飛速進步，人PSCs來源的視網膜色素上皮細胞移植治療年齡相關性黃斑變性的臨床試驗已經開展，而利用PSCs誘導LBs植入眼內替代混濁的晶狀體，作為一種值得探索的白內障新療法，其可行性目前仍有諸多難點需要解決，這或許需要借助多學科交叉融合，利用生物材料和組織工程技術研發細胞支架和載體，從而支撐并引導干細胞增生分化為理想的三維結構；同時也需要眼科研究者對調控晶狀體再生的信號通路和干細胞微環境進行更加深入細致的探索，培養出標準化且具備屈光性能的再生晶狀體，推進晶狀體類器官治療白內障早日實現臨床轉化。

利益沖突