7株橡膠樹膠孢炭疽菌拮抗放線菌的分離及拮抗活性初步評價

王 蕊，王麗娟，和桂青，侯志江，和加衛，李兆光，李 燕，和瓊姬

（云南省農業科學院 高山經濟植物研究所，云南 麗江 674100）

膠孢炭疽菌（Colltootrichum gloeosporioides）是半知菌類、刺盤孢屬的一種真菌，是熱帶、亞熱帶國家最常見的炭疽菌總群，是炭疽屬內最大的一個種群［1］。膠孢炭疽菌種類繁多，寄主范圍廣泛，可以侵染橡膠、香蕉、荔枝等重要的經濟作物，在生長過程中引起較嚴重的炭疽?。?］。

膠孢炭疽菌的致病性較強，是引起橡膠樹炭疽病的主要病原，而橡膠炭疽病是橡膠樹常發病害之一，在橡膠的種植區分布較廣［3］，對小樹苗、幼樹、成齡膠樹都能產生危害［4］。橡膠炭疽病致使橡膠樹的葉片組織大量壞死、葉片大量掉落、樹體弱化，同時還會縮減割膠的時間限期，最終會導致橡膠產量的明顯下滑。而且我國每年因橡膠炭疽病侵染危害的橡膠樹種植面積高達2萬hm2以上，由此導致了干膠產收損失近萬噸，嚴重影響了我國橡膠產業及社會經濟的發展［5］。

目前，橡膠樹炭疽病的防治以化學防治為主，常選用噻菌靈等苯并咪唑類農藥和咪鮮胺等麥角甾醇類生物合成制劑及其復配劑等［6］。然而，長期使用農藥，易導致病害防治效果不理想并產生抗藥性等問題，同時，農藥會造成土壤污染及水資源污染，嚴重破壞生態環境［7］。生物防治因具運用便捷、高效［8］、耗能低，而且對植物本身和環境均相對安全，防治效果明顯、不易導致抗藥性等優點，成為如今各類植物病害綠色綜合防控研究中的重點和熱點［9］。

放線菌因能對許多細菌和真菌產生較強的抑制作用，常用于生物防治。放線菌在自然界中分布廣泛，主要存在和分布于土壤、海洋、動植物體等多元的環境中，具有關鍵的生態學功能［10］。研究表明：利用土壤中的拮抗放線菌來控制植物病害發生已在眾多重要經濟作物病害的防治中得到廣泛的研究和應用［11］。

本研究對采自甘肅省嘉峪關七一冰川的土樣進行放線菌的分離，以膠孢炭疽菌等共5種病原真菌為靶標菌，對分離到的放線菌進行拮抗活性測定。旨在篩選出能產生某些抗菌物質并可用于生物防治的有益菌株，并為進一步研究和開發創新生物防治技術提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤來源 采自甘肅省嘉峪關的七一冰川。

1.1.2 供試植物病原真菌 膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）、香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporumf. sp. cubense）、火龍果潰瘍病菌（Neoscytalidium dimidiatum）、芒果蒂腐病菌（Dothiorella dominicana），均由海南大學熱帶農林學院提供。

1.1.3 培養基 高氏1號培養基、PDA培養基、LB培養基、小米培養基，具體配方詳見文獻［1］。

1.2 試驗方法

1.2.1 放線菌菌株的分離與純化 （1）土壤樣品的采集。釆集土樣時，先鏟去表層土，挖5～10 cm深度的土壤并裝入無菌牛皮紙帶內，封好袋口并做好標記［12］。將采集樣本帶回實驗室混合過篩，自然風干7～10 d后再進行分離操作［13］。

（2）土壤稀釋液的制備。稱取10 g土樣，研磨至粉末狀后，將土樣粉末倒入含90 mL無菌水和少量玻璃珠的錐形瓶中，在28 ℃、160 r/min條件下振蕩20 min，即成10-1濃度的土壤懸液。靜置片刻后，進行梯度稀釋，用移液槍吸取上層溶液1 mL至裝有9 mL的無菌水試管中，混合均勻，制成10-2稀釋液，依次制成10-3和10-4土壤稀釋液［14］。

（3）稀釋涂布法分離放線菌。取出制備好的土壤稀釋液，用移液槍分別從濃度為10-2、10-3和10-4的土壤稀釋液中吸取100 μL稀釋液，均勻涂布于高氏1號平板上，于28 ℃條件下倒置培養7 d。

放線菌菌落的特征：不濕潤、較干、小型、不透明、表面呈致密的絲絨狀，上覆有一層“干粉”；菌落和培養基之間的連接較為緊密，不易挑??；菌落的正反兩面通常會呈現出不同的顏色［15］。

（4）菌株的純化。采用平板劃線分離法純化菌株。用接種環挑取平板上的單菌落分別至高氏1號培養基上進行劃線分離，于28 ℃條件下培養7 d，觀察菌落的生長情況，待有單菌落長出后備用。

1.2.2 拮抗放線菌的初篩 采用平板對峙法進行初篩。將分離出的放線菌以膠孢炭疽菌為靶標菌，測定放線菌的抑菌活性，具體操作如下：用接種環挑取適量放線菌，在距培養皿中心2 cm處各畫一條貫穿培養皿的平行直線，再用直徑為5 mm的打孔器打取膠孢炭疽菌的菌餅，接種于平板中央；以只接病原菌菌餅的平板作為對照，于28 ℃條件下培養7 d后觀察，利用十字交叉法測量平板中菌落的直徑，并根據公式計算抑制率［16］。計算公式如下：

1.2.3 7株放線菌對4種病原真菌抑菌活性的測定 運用1.2.2的方法，以膠孢炭疽菌為靶標菌篩選出7株拮抗活性較強的放線菌，進一步測定其對其他4種病原真菌（香蕉炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、芒果蒂腐病菌和火龍果潰瘍病菌）的皿內拮抗作用。

1.2.4 7株放線菌發酵液的制備 將放線菌菌株接種于高氏1號培養基上，于28 ℃條件下培養7 d，待放線菌長出單菌落后，挑取單菌落接種于裝有10 mL LB培養基的離心管中。于28 ℃、180 r/min條件下振蕩培養3 d后，再按10%的接種量接種于裝有100 mL小米培養基的錐形瓶中，于28 ℃、160 r/min條件下振蕩培養7 d。發酵產物經12000 r/min離心5 min后得到菌體和發酵液2部分，發酵液備用。

1.2.5 7株放線菌發酵液活性的測定 取1 mL發酵液與10 mL PDA培養基（冷卻至55 ℃左右）混合，倒板，以只加10 mL PDA培養基的平板作為對照，將培養5～7 d的靶標菌用打孔器打取直徑5 mm的菌塊，并接種于平板中央，3組重復。在28 ℃條件下培養，采用十字交叉法測定靶標菌菌落直徑，根據公式（1）計算放線菌的抑制率。

1.2.6 菌株QY-26發酵液的制備及其對4種病原真菌抑菌活性的測定 制備菌株QY-26的發酵液，測定菌株QY-26對4種病原真菌（香蕉炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、芒果蒂腐病菌和火龍果潰瘍病菌）的拮抗作用。方法同上。

2 結果與分析

2.1 涂布法分離放線菌的結果

通過稀釋涂布法、平板劃線分離法，從七一冰川土樣中共分離得到28株放線菌，并依次標記為QY-1、QY-2、…、QY-28。并獲得多個獨立分布的單細胞［17］，為下一步試驗作準備。詳見圖1。

圖1 通過平板劃線法分離出的部分放線菌

2.2 放線菌對膠孢炭疽病菌皿內拮抗活性的初篩

對分離出的28株放線菌采用平板對峙法進行初篩后，得到7株拮抗活性較顯著的放線菌，編號分 別 為：QY-2、QY-8、QY-9、QY-13、QY-23、QY -26和QY-28。根據公式（1）計算，其抑制率分別為93.8%、79.3%、95.0%、41.3%、98.7%、88.8%、97.3%。其中，抑制率最高的是QY-23，其抑制率達98.7%。結果詳見圖2和表1。

圖2 部分放線菌對膠孢炭疽病菌皿內拮抗活性初篩試驗結果

表1 部分放線菌對膠孢炭疽菌的抑制率 %

2.3 7株放線菌對4種病原真菌的抑菌活性

以膠孢炭疽菌為靶標菌，初篩出抑菌活性較好的菌株為QY-2、QY-8、 QY-9、QY-13、QY-23、QY-26和QY-28。將這7株放線菌在皿內測定其對香蕉炭疽病菌、火龍果潰瘍病菌、芒果蒂腐病菌和香蕉枯萎病菌這4種病原真菌的抑菌活性。結果發現：在7株放線菌中，菌株QY-2、QY-8、QY-9和QY-23對芒果蒂腐病菌的抑制率達100.0%；菌株QY-2、QY-26和QY-28對香蕉炭疽病菌的抑制率達100.0%；菌株QY-8和QY-23對火龍果潰瘍病菌的抑制率達100.0%；菌株QY-28對香蕉枯萎病菌的抑制率達100.0%。綜合分析，在7株放線菌中，QY-2的抑菌效果最好、抑菌譜最廣，抑制率最高為98.7%，最低為96.3%；而QY-13的抑菌效果最差，抑制率最高僅為49.3%。結果見圖3和表2。

表2 7株放線菌對4種病原真菌的抑制率 %

圖3 部分放線菌對4種病原真菌的皿內活性測定結果

2.4 7株放線菌發酵液活性的測定

取適量發酵液制作玻片，通過顯微鏡觀測，發現備用發酵液中有菌絲存在，可開展下一步試驗操作。以膠孢炭疽菌為靶標菌，對QY-2、QY-8、QY-9、QY-13、QY-23、QY-26和QY-28這7株放線菌進行發酵液活性測定。結果發現：QY-26、QY-8、QY-13和QY-28這4株放線菌發酵液具有活性，且抑制率分別為77.8%、48.9%、6.7%和4.8%。放線菌QY-2、QY-9、QY-23的抑制率則均為0。結果詳見圖4和表3。

表3 7株放線菌發酵液活性的測定 %

圖4 7株放線菌發酵液活性測定結果

2.5 菌株QY-26發酵液抑菌活性的測定

進一步將菌株QY-26的發酵液對香蕉炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、火龍果潰瘍病菌和芒果蒂腐病菌進行活性測定。結果表明：菌株QY-26除了對膠孢炭疽菌有較好的抑制作用外，對香蕉炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、火龍果潰瘍病菌和芒果蒂腐病菌也具有抑制作用，抑制率分別為77.8%、54.3%、54.0%和45.2%。結果詳見圖5和表4。

表4 菌株QY-26發酵液對4種病原真菌的皿內拮抗活性

圖5 菌株QY-26發酵液對4種病原真菌的活性測定結果

3 結論與討論

3.1 結論

本研究以膠孢炭疽菌為靶標菌，利用平板對峙法，對從甘肅省嘉峪關七一冰川土樣中分離的放線菌進行皿內活性測定，共得到QY-2、QY-8、QY-9、QY-13、QY-23、QY-26和QY-28這7株活性較強的放線菌。進一步測定發現，這7株放線菌對香蕉炭疽病、香蕉枯萎病菌、芒果蒂腐病菌、火龍果潰瘍病病菌4種病原真菌都具有抑制作用。

再以膠孢炭疽菌為靶標菌對這7株放線菌發酵液進行活性測定。結果發現：菌株QY-26、QY-8、QY-13和QY-28的發酵液具有一定抑菌活性。分析對比發現，菌株QY-26發酵液的抑菌活性最好。進一步測定發現，菌株QY-26發酵液對香蕉炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、火龍果潰瘍病菌和芒果蒂腐病菌這4種病原菌具有不同程度的抑制作用。

綜合發現，菌株QY-26對于5種病原菌都具有一定的抑制作用，其中對膠孢炭疽菌的抑制作用最強。

3.2 討論

本試驗在以膠孢炭疽菌為靶標菌對放線菌進行初篩時，發現菌株QY-23活性最強，抑制率高達98.7%，但其發酵液活性檢測中抑制率卻為0。對此推測以下可能：（1）由于放線菌時間太長而已經失活；（2）放線菌的活性物質不存在于發酵液的上清液中，而是存在于離心后的沉淀物中；（3）培養基不適合該活性物質生長；（4）傳代次數過多，導致活性物減少甚至完全喪失。

本試驗以放線菌為基礎，通過試驗總結發現，因土壤中不僅具有放線菌還有細菌，整個試驗過程中常伴有細菌污染現象，對此現象的原因分析和具體有效防止措施有待研究；或對該種細菌與被污染放線菌間是否具有相同習性或之間是否具有相關聯系進行試驗研究；或對放線菌菌株QY-26的發酵液中活性物質進行研究，對其發酵液的沉淀物中是否含活性物質進行試驗，進一步測定QY-26的抑制作用，以完善和開發其生物防治的效果，為進一步開發創新生物防治技術提供理論依據。