香葉天竺葵組培苗與扦插苗有效活性成分測定及其抗氧化活性研究

楊曉瓊，何 璐，廖承飛，金 杰，袁建民，許智萍，范建成，雷 虓

（云南省農業科學院 熱區生態農業研究所/元謀干熱河谷植物園，云南 元謀 651300）

0 引言

香葉天竺葵（Pelargonium graveolens L’Herit.）為牻牛兒苗科（Geraniaceae）天竺葵屬（Geranium）多年生芳香植物［1］。20世紀50年代初引入我國栽培［2］，現主產于云南［2］，其莖和葉中提取的香葉天竺葵精油廣泛用于香水、化妝品、制藥和食品工業［3］。全草可入藥［4］，在民間醫學中被用于治療各種疾病，具有抗菌、抗病毒、抗氧化［5］、鎮痛［6］、抗寄生蟲［7］、抗結核［8］等生物活性，除藥理特性外，因其抗氧化特性而被廣泛應用于食品和化妝品行業［9］。對香葉天竺葵有效成分的研究主要集中于揮發性成分，其中香葉天竺葵精油揮發性成分中含量較高主要有香茅醇、香葉醇、芳樟醇等［10-11］。除了揮發性成分，香葉天竺葵中還含有總酚、黃酮、黃酮醇和縮合單寧等化學成分［1，12-13］，作為非揮發有效化學成分，黃酮類化合物具有抗炎［14］、抗氧化［15］、清除自由基［15］、提高免疫力、止痛、預防心腦血管疾病等多種藥理活性；總酚化合物具有抗氧化、抗脲酶、抗酪氨酸酶和光保護作用［12］。

目前，香葉天竺葵常用的無性繁殖技術有扦插、組織培養2種方式，其中扦插為最常用的繁殖技術，具有省時、省力、操作簡單、設備成本低、培育周期短等優點［16］；組織培養是一種有效的快繁方法，可以在短期內用較少的原始材料獲得健康、無病的植株［16］。

國內外學者們對香葉天竺葵非精油有效活性成分及抗氧化活性進行了相關研究，但對于不同繁殖技術條件下的有效活性成分及抗氧化活性未見相關報道。袁萌芽等［4］利用乙醇、水和乙酸乙酯提取法提取了香葉天竺葵中的非精油有效活性組分，研究了非精油組分對·OH、DPPH、ONOO-和O2-等自由基、活性氧的清除能力，結果表明，乙醇、水和乙酸乙酯提取物［4］對·OH、DPPH、ONOO-和O2-的清除率明顯，可以作為一種有效的自由基清除劑和天然抗氧化劑；Soukaina等［12］利用有機提取劑提取了香葉天竺葵中的非揮發總酚、黃酮、黃酮醇和縮合單寧并對其進行抗氧化、酶抑制、光保護和抗菌作用的體外研究，發現甲醇提取物具有顯著的抗氧化、抗脲酶、抗酪氨酸酶和光保護作用，其中甲醇提取物的酚類化合物含量最高，且所有提取物都表現出由弱至中等的抗菌活性；Fekri等［1］研究了香葉天竺葵煎劑和浸劑中總酚的抗氧化性能、抗乙酰膽堿酯酶及抗菌活性，發現浸劑的總酚含量與煎劑的有顯著差異，但均表現出較高的抗乙酰膽堿酯酶活性和對金黃色葡萄球菌較強的抗菌活性。

目前，雖然已有少量關于香葉天竺葵非精油有效成分的抗氧化活性方面的研究，但主要集中在相同繁殖技術條件下香葉天竺葵資源的活性研究方面，對扦插繁殖和組織培養繁殖的香葉天竺葵的非精油有效成分及其抗氧化活性研究未見相關報道。通過紫外-可見分光光度法、Folin-酚比色法測定香葉天竺葵組培苗與扦插苗中總黃酮、總酚含量，并對該方法進行方法學考察［14］，同時采用DPPH自由基法和羥自由基（·OH）法分析香葉天竺葵組培苗與扦插苗的抗氧化活性，篩選出最佳的繁殖技術方式，為香葉天竺葵作為天然抗氧化劑提供科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

香葉天竺葵供試材料來源于云南省賓川縣香葉天竺葵種質資源的組培苗與扦插苗。2018年3月種植于云南省農業科學院熱區生態農業研究所香葉天竺葵試驗基地。經云南農業大學香料研究所任洪濤副研究員鑒定為牻牛兒苗科（Geraniaceae）天竺葵屬（Geranium）香葉天竺葵（Pelargonium graveolens L’Herit.）的干燥全草，植物標本保存于云南省農業科學院熱區生態農業研究所實驗樓，取苗齡為2年的組培苗與扦插苗鮮樣葉部位，于65～70 ℃鼓風干燥箱烘至恒重，粉碎后過40目尼龍篩，保存備用。蘆丁標準品（HPLC≥98%）購自北京世紀奧科生物技術有限公司；DPPH（純度≥98%，批號217-591-8）購自日本東京化成工業株式會社；沒食子酸對照品（純度99.8 %，批號110831）購自中國食品藥品檢定研究院；水楊酸（分析純）購自上?；瘜W試劑有限公司試劑廠；硫酸亞鐵（分析純）購自天津市風船化學試劑科技有限公司；無水乙醇（分析純）、過氧化氫（分析純）、碳酸鈉（分析純）、石油醚（分析純）均購自國藥集團化學試劑有限公司；福林酚試劑（1.0 moL/L）購自索萊寶生物科技有限公司；L-抗壞血酸（維生素C）對照品購自萬佳標準物質研究中心。

主要儀器設備：Spectra Max Plus 384酶標儀（美國Molecular Device公司）；UV330紫外可見分光光度計（美國熱電）；Eyela 1100D旋轉蒸發儀（東京理化公司）；電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；ATX224萬分之一電子天平（日本島津）；SB-5200D超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；UPH-IV-20T超純水儀（中國優普）；GZX-9140MBE電熱恒溫鼓風干燥箱（上海博訊）；粉碎機（永康市速峰工貿有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 香葉天竺葵組培苗與扦插苗非精油組分的提取 香葉天竺葵組培苗與扦插苗非精油組分的提取參照袁萌芽等［4］利用乙醇提法提取香葉天竺葵組培苗與扦插苗中非精油組分的方法進行。

1.2.2 香葉天竺葵組培苗與扦插苗總黃酮含量測定

1.2.2.1 蘆丁標準曲線繪制 參考楊曉瓊等［15］測定蘆丁標準曲線的方法進行，稍加修改，得到蘆丁在0～0.03 mg/mL濃度范圍內的標準曲線回歸方程為：y=11.308x+0.0005 （R2=0.9995）。

1.2.2.2 總黃酮含量的測定 分別稱取組培苗與扦插苗褐色粉末提取物各25.0 mg 2份，利用70%乙醇溶液溶解，配制成2.5 mg/mL的溶液定容至10 mL的棕色容量瓶中，分別取1.0 mL樣品液于50 mL棕色容量瓶中，其余步驟與1.2.2.1蘆丁標準曲線的制定方法相同，進行3次重復，計算組培苗與扦插苗樣品中總黃酮的平均含量。

1.2.2.3 香葉天竺葵組培苗方法學考察 以香葉天竺葵組培苗為方法學考察的試驗對象，分別開展以下試驗：（1）穩定性考察，將香葉天竺葵組培苗按1.2.2.2方法制備樣品，取1.0 mL樣品液于50 mL棕色容量瓶中，其余步驟與1.2.2.1蘆丁標準曲線的制定方法相同，每隔1 h測定1次吸光度值，共測6次。（2）精密度考察，方法同（1），分別進行5次測定。（3）重復性考察，取香葉天竺葵組培苗樣品6份，按1.2.2.2方法制備樣品，分別取1.0 mL樣品液于50 mL棕色容量瓶中，其余步驟與1.2.2.1蘆丁標準曲線的制定方法相同，測定6份樣品的吸光度值。（4）回收率考察，精密稱取香葉天竺葵組培苗樣品粉末0.1 g 9份，分為3組，向每組樣品中分別加入樣品含量的50%、100%和150%的蘆丁標準品溶液，按1.2.2.2方法制備樣品，分別取1.0 mL樣品液于50 mL棕色容量瓶中，其余步驟與1.2.2.1蘆丁標準曲線的制定方法相同，并測定510 nm處的吸光值，計算回收率和相對標準偏差（RSD）。

1.2.3 香葉天竺葵組培苗與扦插苗總酚含量測定

1.2.3.1 沒食子酸標準曲線的繪制 參考王興瑞等［17-18］的研究方法，稍加修改，得到沒食子酸在0～0.036 mg/mL濃度范圍內的標準曲線回歸方程為：y=30.19x+0.0033 （R2=0.9991）。

1.2.3.2 總酚含量的測定 分別稱取組培苗與扦插苗褐色粉末提取物各25.0 mg 2份，利用70%乙醇溶液溶解，配制成1 mg/mL的溶液定容至25 mL棕色容量瓶中，采用Folin-酚比色法，取0.3 mL的樣品液于10 mL棕色容量瓶中，其余步驟與1.2.3.1沒食子酸標準曲線的制定方法相同，進行3次重復，通過標準曲線計算組培苗與扦插苗樣品中總酚的平均含量。

1.2.3.3 香葉天竺葵組培苗方法學考察 同理，以香葉天竺葵組培苗為方法學考察的試驗對象，參考1.2.2.3的方法對香葉天竺葵組培苗進行方法學考察，稍加修改。

1.2.4 香葉天竺葵組培苗與扦插苗抗氧化活性研究1.2.4.1 DPPH自由基清除率測定 參照王彥兵［19］、Soukaina［12］等的研究方法，選用L-抗壞血酸作陽性對照，稍加修改。根據公式（1）計算DPPH自由基清除率：

公式（1）中，Ai為樣品溶液吸光值，Aj為無水乙醇代替DPPH溶液的對照組吸光值，Ac為純水代替樣品溶液的空白組吸光值。

1.2.4.2 羥自由基清除率測定 參照黃秋萍等［20］的研究方法，稍加修改，選用L-抗壞血酸作陽性對照。根據公式（2）計算羥自由基清除率：

公式（2）中，A為樣品溶液吸光值，A1為純水代替過氧化氫溶液的對照組吸光值，A0為純水代替樣品溶液的空白組吸光值。

1.2.5 統計分析 利用Origin 8.6、SPSS 21.0和Excel 2016軟件對試驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 方法學考察結果

2.1.1 總黃酮含量測定方法學考察結果 （1）穩定性試驗結果顯示，供試品放置5 h內的RSD為1.15%，小于2%，表明供試品溶液在制備顯色5 h內穩定。（2）精密度試驗結果顯示，5次試驗測得香葉天竺葵總黃酮含量分別為0.931%、0.909%、0.909%、0.893%、0.909%和0.893%，平均值為0.907%，相對標準偏差（RSD）=1.54% （n=6），說明儀器精密度良好。（3）重復性試驗結果顯示，香葉天竺葵組培苗樣品中總黃酮的平均含量為0.911%，RSD=1.87% （n=6），表明該總黃酮含量的測定方法重復性較好。（4）由樣品平均加標回收試驗結果顯示（表1），樣品的平均加標回收率為97.30%，RSD為1.29%，說明回收率良好。

表1 香葉天竺葵組培苗加標回收率考察結果

2.1.2 總酚含量測定方法學考察結果 （1）穩定性試驗結果顯示，供試品放置3 h內的RSD為1.30%，表明供試品溶液在制備顯色3 h內穩定。（2）精密度試驗結果顯示，測得香葉天竺葵總酚含量分別為1.125%、1.118%、1.145%、1.145%、1.152%和1.152%，平均值為1.140%，RSD=1.27% （n=6），說明儀器精密度良好。（3）重復性試驗結果顯示，測得的香葉天竺葵組培苗樣品中總酚的平均含量為1.124%，RSD=1.86%（n=6），表明該總酚含量的測定方法重復性較好。（4）由樣品平均加標回收試驗結果（表2）可知，樣品的平均加標回收率為97.94%，RSD為0.58%，說明回收率較好。

表2 香葉天竺葵組培苗加標回收率考察結果

2.2 香葉天竺葵組培苗和扦插苗總黃酮、總酚含量測定結果

由表3可知，不同繁殖技術條件下，香葉天竺葵組培苗總黃酮（0.911%）與扦插苗總黃酮（0.86%）含量無顯著差異，但組培苗中總酚含量（1.124%）顯著高于扦插苗總酚含量（0.92%），且總酚含量均高于總黃酮含量，說明繁殖技術方式對總黃酮含量的影響較小，但對其體內總酚成分的合成與積累可能具有一定影響。

表3 香葉天竺葵組培苗與扦插苗中總黃酮、總酚含量的測定結果

2.3 香葉天竺葵組培苗和扦插苗的抗氧化活性比較結果

不同繁殖技術條件下香葉天竺葵對DPPH、羥自由基清除能力的曲線方程、相關系數及半抑制濃度（IC50）如表4所示。根據IC50值來評價組培苗和扦插苗有效成分清除DPPH和羥自由基能力的強弱，IC50值越小，清除能力就越強［14］。

表4 組培苗與扦插苗對DPPH、羥自由基清除能力的曲線方程、相關系數及IC50

2.3.1 DPPH自由基清除能力測定結果 由表4可知，組培苗和扦插苗有效成分清除DPPH自由基的IC50分別為16.72和18.86 μg/mL，相關系數分別為0.9911、0.9901，組培苗對DPPH自由基的清除率高于扦插苗，這和上述組培苗中總酚含量高于扦插苗是一致的，因為總酚化合物具有抗氧化、清除自由基的功效［12］，總酚含量與自由基的清除效果呈正比例關系。組培苗、扦插苗有效成分和L-抗壞血酸對DPPH自由基的清除率如圖1所示。由圖1可知，DPPH自由基的清除率隨組培苗、扦插苗有效成分和L-抗壞血酸質量濃度的增加呈上升趨勢，質量濃度為30 μg/mL時，清除率分別為82.3%、76.9%、96.5%，其中L-抗壞血酸對DPPH自由基的清除率的抑制方程為：y=4.0357x+25.781（R2=0.9907），IC50=5.63 μg/mL，由IC50值可看出組培苗和扦插苗有效成分對DPPH自由基的清除率是L-抗壞血酸的33.6%和29.8%，說明組培苗和扦插苗有效成分均對DPPH自由基具有清除效果，但清除效果顯著低于L-抗壞血酸，這可能是因為利用乙醇法提取的組培苗和扦插苗中有效成分未完全浸出，且純度較低的緣故［19］。

圖1 香葉天竺葵組培苗與扦插苗對DPPH自由基 清除率的比較

2.3.2 羥自由基（·OH）清除能力測定結果 羥自由基是一種能快速進行多種生化反應的自由基，氧化能力極強，會導致人體多種病變的產生，通過測試天然產物對羥自由基的清除效果，可作為一種表征天然產物的抗氧化活性的手段［20］。從表4可知，組培苗和扦插苗有效成分清除羥自由基的IC50分 別 為443.92和467.92 μg/mL，相 關 系 數分別為0.9940、0.9916，組培苗對·OH的清除率高于扦插苗。組培苗、扦插苗有效成分和L-抗壞血酸對·OH的清除率如圖2所示。由圖2可知，組培苗、扦插苗有效成分和L-抗壞血酸對·OH的清除率與質量濃度呈正相關，濃度越大清除效果越顯著。在最大濃度500 μg/mL時，組培苗、扦插苗和L-抗壞血酸的清除率分別為57.5%、53.7%、90.7%，其中L-抗壞血酸對·OH的清除率的抑制方程為：y=0.1901x-7.834 （R2=0.9902），IC50=304.88 μg/mL，由IC50值可看出組培苗和扦插苗有效成分對·OH的清除率是L-抗壞血酸的68.7%和65.2%，說明組培苗和扦插苗有效成分均對·OH自由基具有清除效果，但清除效果低于L-抗壞血酸，可能是因為利用乙醇法提取的扦插苗和組培苗中有效成分未完全浸出，且純度較低的緣故［19］。

圖2 香葉天竺葵組培苗與扦插苗對羥自由基清除率的比較

3 討論

本研究通過利用紫外-可見分光光度法、Folin -酚比色法測定香葉天竺葵組培苗與扦插苗中總黃酮、總酚含量，研究結果發現，組培苗總黃酮含量（0.911%）和扦插苗總黃酮含量（0.860%）無顯著差異，組培苗中總酚含量為1.124%，顯著高于扦插苗總酚含量（0.92%），且總酚含量高于總黃酮含量，說明繁殖技術方式對總黃酮含量的影響性較小，但對其體內總酚成分的合成與積累可能具有一定影響。香葉天竺葵組培苗和扦插苗總黃酮含量與袁萌芽等［4］利用醇提法提取香葉天竺葵總黃酮含量（0.93%）相比，相差不大。但組培苗中總酚含量為1.124%顯著高于袁萌芽等［4］的香葉天竺葵總酚含量（0.93%），與扦插苗總酚含量（0.92%）差異顯著，說明有效活性成分總黃酮、總酚含量可能受氣候、地域、品種、繁殖方式、提取方法等的影響［21］，其含量會存在一定的差異，但利用組培的繁殖技術方式更有利于有效活性成分的積累。

對組培苗和扦插苗有效成分進行抗氧化活性評價，結果表明香葉天竺葵組培苗對DPPH自由基和·OH的清除率均高于扦插苗（組培苗清除DPPH自由基和·OH的IC50分別為16.72和443.92 μg/mL，扦插苗分別為18.86和467.92 μg/mL）。與袁萌芽等［4］利用香葉天竺葵非精油組分醇提物對DPPH的清除能力（清除DPPH的IC50分別為17.08 μg/mL）相比，組培苗清除DPPH自由基的能力更強，說明采用組培的繁殖方式具有更強的自由基清除能力，這和上述組培苗有效活性成分含量較高相協調的，因為有效活性成分含量與自由基的清除能力成正比。Soukaina等［12］利用香葉天竺葵醇（甲醇）提取物和己烷提取物研究清除DPPH的清除能力，發現甲醇提取物和己烷提取物清除DPPH自由基和·OH的IC50分別為12.96和37.60 μg/mL，說明利用醇提物清除DPPH自由基的能力更強，尤其是利用甲醇作為提取物，對DPPH自由基的清除能力明顯提高，但甲醇有一定毒性，對人體易造成傷害，改用乙醇作為提取劑，安全無毒且可回收利用［22］，所以本研究選擇利用乙醇提取香葉天竺葵中有效活性成分。研究中還發現，組培苗和扦插苗的抗氧化能力隨有效成分質量濃度的增加而增強，這與張福平［23］、趙國超等［14］研究發現有效成分的抗氧化能力隨其質量濃度的增加而增強的結果一致。

天然產物中提取的有效活性成分具有抗氧化作用，天然抗氧化劑相比于合成抗氧化劑［24］，具有活性強、毒性小的優勢［24］，當2種或多種有效活性成分共同使用時，因存在協同作用，抗氧化活性更強，本研究中香葉天竺葵組培苗和扦插苗同時含有總黃酮和總酚2種抗氧化活性成分，因此，本研究中對DPPH自由基和·OH的清除作用可能是總黃酮與總酚協同作用所產生的。過量自由基會引發各種疾病，如心腦血管疾病、腫瘤等［25］，同時還會加速人體衰老，天然抗氧化劑具有清除自由基的功效，因此，從植物中提取的抗氧化劑在食品、醫藥及材料等研究領域具有較大的應用前景［25］。目前，由于體內活性試驗存在耗時長、成本高等不足，抗氧化活性物質的篩選主要集中于體外模擬測試試驗［26］，本研究也是利用體外進行抗氧化活性研究。

本研究結果表明，組培苗和扦插苗有效成分對DPPH自由基和·OH具有清除作用，且清除率與質量濃度呈正比例關系，但其清除效果均低于L-抗壞血酸，這可能是因為試驗所用的香葉天竺葵有效成分的純度不高，摻有一定量的雜質，從而影響多酚類物質的共軛結構以及有效成分之間的協同作用［19］。組培苗有效成分對DPPH自由基和·OH清除能力的IC50分別為16.72和443.92 μg/mL，分別是L-抗壞血酸清除能力的33.6%和68.7%；扦插苗的IC50分別為18.86和467.92 μg/mL，分別是L-抗壞血酸清除能力的29.8%和65.2%，試驗結果說明，香葉天竺葵組培苗和扦插苗具有一定的抗氧化活性，但對不同自由基清除能力存在差異，這主要是由多酚類化合物結構所決定。多酚類化合物通過單電子轉移和氫原子轉移直接清除自由基［27］，或通過化合物的羥基位置和數量直接影響抗氧化活性［28］，而組培苗的抗氧化活性強于扦插苗，因此，在產業化種植的情況下可以考慮選擇組培的方式進行繁殖，不僅清除自由基的能力較強，而且組培苗具有抗性強、次生代謝物含量增加、不易致病害等優勢，這和易清元等［29］的香葉天竺葵多倍體（組培苗）苗研究結果一致。本研究對不同繁殖技術條件下的香葉天竺葵進行了抗氧化活性研究，但抗氧化活性評價因素較少，未能確定香葉天竺葵中起抗氧化作用的具體有效單體成分，因此，下一步將對超氧陰離子自由基、ABTS自由基等還原能力進行考察，同時分離和純化香葉天竺葵組培苗和扦插苗有效單體成分，最終確定香葉天竺葵中的生物活性成分。

4 結論

本研究對香葉天竺葵的組培苗和扦插苗進行了抗氧化活性研究，建立的香葉天竺葵中總黃酮和總酚含量測定方法操作簡單、快捷，具有良好的穩定性、線性、重復性、精密度和回收率。香葉天竺葵的組培苗具有較強的抗氧化活性，所以在繁殖香葉天竺葵時可采用組培的方式進行繁殖，同時香葉天竺葵的有效活性成分可作為天然抗氧化劑進行開發，在化妝品、藥品和食品等方面具有一定的開發利用前景。