嘉定梅山豬氣喘病的血液生理生化及免疫指標檢測分析

涂尾龍，吳華莉，張鶯鶯，王洪洋，黃 濟，曹建國，衛金良，甘葉青，唐賽勇，談永松*

（1.上海市農業科學院 畜牧獸醫研究所，上海 201106；2.上海種豬工程技術研究中心，上海 201106；3.上海市嘉定區動物疫病預防控制中心，上海 201800）

梅山豬是我國南方太湖流域具有高產仔數特性的地方品種，曾經被譽為生豬產仔冠軍，其肉質鮮美［1］。目前梅山豬有4個保種場：上海市嘉定區梅山豬育種中心、昆山市種豬場、江蘇農林職業學院及太倉市種豬場。按體型大小分為中梅山豬和小梅山豬，嘉定梅山豬屬于中梅山豬。氣喘?。‥nzootic Pneumonia， EP）是由豬肺炎支原體（Mycoplasma Hyopneumoniae， Mhp）引起的豬支原體肺炎，具有高度傳染性、致病率和低死亡率［2］。嘉定梅山豬時有氣喘病發生，尤其是在寒冷冬季或季節交替的時節，會給豬場造成重大的經濟損失。即使在有免疫后，仍有部分豬發病，難以根除。2017年，朱效俊等［3］在研究不同支原體疫苗對梅山豬氣喘病的影響中發現，支原體疫苗瑞倍適免疫過的梅山豬，50日齡的梅山豬抗體陽性率為50%，160日齡的梅山豬抗體陽性率為55.56%，免疫效果并不佳。本研究以嘉定梅山豬為試驗對象，在冬季氣喘病高發時，檢測氣喘病發作的梅山豬血液中血常規、生理生化及免疫指標，分析并找出其差別。并以此為標準，在各個季節對梅山豬群體進行篩選，找出梅山豬氣喘病的潛在群體，進行采樣，為進一步篩選梅山豬氣喘病的相關基因及基因表達量的規律提供參考，從而更好地指導梅山豬篩選抗氣喘病豬的選育工作。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

上海市嘉定區梅山保種場，純種梅山豬60頭，其中30頭具有氣喘病癥狀， 30頭正常。

1.2 血液采集

使用醫用的采血管和采血針，前腔靜脈采集血液10 mL，分裝2管：1管為加抗凝劑，用于檢測血常規指標；另外1管不加抗凝劑，用于離心，提取血清，用于檢測生化、脂肪代謝、微量元素和免疫等指標。

1.3 檢測指標

1.3.1 血常規指標 使用邁瑞BC-30全自動血液分析儀檢測梅山豬的血常規指標，包括：白細胞計數（WBC）、紅細胞計數（RBC）、血紅蛋白（HGB）、紅細胞比積（HCT）、平均紅細胞容積（MCV）、平均紅細胞血紅蛋白量（MCH）、平均紅細胞血紅蛋白濃度（MCHC）、血小板計數（PLT）、紅細胞分布寬度標準差（RDW-SD）、紅細胞分布寬度變異系數（RDW-CV）、血小板分布寬度（PDW）、平均血小板體積（MPV）、血小板大細胞比率（P-LCR）、血小板比容（PCT）、中性粒細胞絕對值（NEUT）、淋巴細胞數（LYMPH）、單核細胞數（MONO）、嗜酸性粒細胞數（EO）、嗜堿性粒細胞（BASO）、中性粒細胞百分率（NEUT%）、淋巴細胞百分率（LYMPH%）、單核細胞百分率（MONO%）、嗜酸性細胞百分率（EO%）、嗜堿性細胞百分率（BASO%）。

1.3.2 血清生化指標、脂肪代謝指標和微量元素 使用普朗SMT100儀器檢測梅山豬血生化、脂肪代謝、微量元素指標，包括：谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLOB）、血清白/球蛋白（A/G）、谷氨酪轉肽酶（GGT）、血糖（GLU）、尿素氮（Urea）、肌酐（Crea）、鈣（Ca）、磷（P）、總膽固醇（CHOL）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、鉀（K）、鈉（Na）、血清氯（Cl）、血清膽堿酯酶（CHE）。

1.3.3 免疫指標 購買ELISA試劑盒檢測梅山豬免疫調節因子指標IL-2、IL-4、IL-8；檢測天然免疫因子IFN-γ和TNF-α；檢測蛋白抗體IgA、IgG、IgM；補體因子C3、C4。

1.4 數據分析

所有圖表數據均采用SPSS 26.0和Excel 2003軟件進行統計分析，結果用Mean±SE表示，并對數據做獨立樣本t檢驗進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 梅山豬氣喘病的血液常規指標

由表1可知，血液常規指標方面，相對于參考值，氣喘病組的試驗豬血液常規指標部分出現異常，具體為氣喘病組的試驗豬血液WBC、NEUT、NEUT%、LYMPH和LYMPH%大于參考范圍最大值，而HCT、PDW小于參考范圍最小值；正常組均值均在參考范圍值之內，但統計分析時也有個體個別指標在參考范圍外。兩組試驗豬之間WBC、P-LCR、NEUT、NEUT%、 RDW-SD和LYMP這6項指標有極顯著差異（P＜0.01），HCT 、MONO和LYMPH%這3項指標有顯著差異（P＜0.05），其他指標無顯著差異（P＞0.05）。

表1 兩組梅山豬氣喘病的血液常規指標

2.2 梅山豬的血清生化指標、脂肪代謝指標和微量元素

2.2.1 梅山豬的血清生化指標 由表2可知，血清生化指標方面，相對于參考值，兩組都有相關指標出現異常。其中，氣喘病組梅山豬的血清ALT、AST、ALP、Urea和CK這5項指標大于參考范圍最大值，正常組梅山豬的血清中AST、ALP這2項指標大于參考范圍最大值。兩組試驗豬在ALT、ALP、Urea這3項指標上有極顯著差異（P＜0.01），AST有顯著差異（P＜0.05）。

表2 兩組梅山豬氣喘病的血清生化指標

2.2.2 梅山豬的血清脂肪代謝指標 由圖1可知，梅山豬氣喘病的血清脂肪代謝相關指標中，兩組試驗豬在LDH指標有顯著差異（P＜0.05），GLU、TG、CHOL、HDL-C、LDL-C和CHE這些指標無顯著差異（P＞0.05）。

圖1 兩組梅山豬氣喘病的血清脂肪代謝相關指標

2.2.3 梅山豬的血清微量元素 由圖2可知，兩組試驗豬在微量元素相關指標方面均無顯著差異（P＞0.05）。

圖2 兩組梅山豬氣喘病的血清微量元素相關指標

2.3 梅山豬的血清免疫指標

從梅山豬氣喘病血清免疫指標檢測結果我們可以看出（圖3），兩組試驗豬在IgA 、IgG2項指標上有極顯著差異（P＜0.01），在IL-2和IFN-γ這2項指標上有顯著差異（P＜0.05），其他指標無顯著（P＞0.05）差異。

圖3 兩組梅山豬氣喘病的免疫指標

3 討論

3.1 梅山豬的血常規指標分析

在血常規指標中，白細胞分為5類：淋巴細胞、中性粒細胞、單核細胞、嗜堿性粒細胞及嗜酸性粒細胞。它們是機體內與細菌、病毒、支原體等戰斗的“警察部隊”，每種白細胞具體對抗的病原體也不一樣，其中淋巴細胞負責對抗支原體。正常情況下，機體血液中免疫指標如粒細胞、單核細胞和淋巴細胞等都處于一個范圍內波動不變，這是機體免疫功能正常的表現［4-5］。但是，當機體自身發生疾病或者遭受病原微生物侵染時，自身的免疫系統就會針對性地建立防御系統，自身免疫系統的強弱對機體的恢復起決定性作用［6］。另外，由于地方豬在控制淋巴細胞亞類上有其獨特的遺傳特征，這使得地方豬沒有明顯的免疫缺陷而有較高的抵抗力［7］。動物機體的血常規指標是最直接反映動物健康狀態的指標，本研究中的氣喘病組梅山豬血常規指標中的WBC、LYMPH指標超過參考范圍值最大值，也顯著高于正常組（P＜0.05），說明氣喘病組的梅山豬中存在疾病，而且是病毒或者支原體，機體對病原產生抵抗。正常組梅山豬也有個別指標超出參考范圍最大值，這可能是因為個別豬也處于亞健康或者疾病狀態，但無明顯癥狀。當然，如果是不同品種間，也可能會出現顯著差異（P＜0.05），這是因為動物不同品種間控制各項指標的基因座也有顯著差異［8］，但本試驗的豬均為同一個品種，因而排除這種可能，只能是疾病的因素。2018年，陳少康等［9］研究發現，中性粒細胞可以作為診斷豬群是否即將感染或已經處于感染初期的一個輔助指標。本研究中，氣喘病組梅山豬的NEUT、NEUT%指標超出其參考值范圍最大值，且兩組梅山豬之間存在極顯著差異（P＜0.01），進一步驗證了氣喘病組的梅山豬群體處于疾病狀態。P-LCR、RDW-SD這2項指標值高于參考值范圍最大值，其原因可能是動物機體存在炎癥［10］。本研究中，兩組梅山豬血液中的P-LCR、RDW-SD這2項指標均在參考值范圍內，說明了兩組梅山豬機體內還未發生炎癥，但氣喘病組的梅山豬群體極顯著（P＜0.01）高于正常組的梅山豬群體，氣喘病組梅山豬群體可能即將出現炎癥。HGB、MCH和MCHV等指標均在參考值范圍內，兩組也無顯著差異（P＞0.05），說明總的運氧能力還是處于正常狀態，兩組梅山豬無顯著差異（P＞0.05），氣喘病組梅山豬短期無重危癥狀。從梅山豬的血常規指標上來看，基本還是能反映出兩組梅山豬的健康狀況，從而進一步為我們篩選抗氣喘病梅山豬提供數據參考。

3.2 梅山豬的血清生化指標、脂肪代謝指標和微量元素分析

肝臟是動物機體進行轉化和代謝的主要場所，動物血清中的生化指標是判斷動物機體是否受損傷的重要依據。ALT和AST主要存在動物機體的肝細胞的胞漿和線粒體中，這2項指標直接反映了肝細胞或線粒體的受損狀態［11］。ALT還是肝臟參與氨基酸代謝中活性最高的轉氨基活性酶，當肝臟受損時會有大量的ALT進入血清［12］。本研究中，氣喘病組梅山豬ALT異常，且與正常組梅山豬有極顯著差異，說明氣喘病組梅山豬肝臟已經受損；但在AST指標方面，兩組試驗豬都表現異常，且差異極顯著，這可能和品種有關，或者是因為正常組的梅山豬有個體是肝臟受損的。ALP是一種廣泛存在于機體肝臟、骨骼、腎臟等各組織中的酶［13］，不是單一的酶，是一組同工酶，這種酶能催化核酸分子脫掉5′磷酸基團，從而使得DNA或者RNA片段的5′-P末端換成5′-OH末端。本研究中的兩組試驗豬ALP都出現異常，兩組間也出現極顯著差異，這可能是由于梅山豬在骨骼方面都存在或多或少的疾病而導致的，氣喘病組梅山豬群體由于氣喘病導致骨骼疾病更加明顯，使得堿性磷酸酶異常。TP、GLOB、ALB、A/G等指標和蛋白質的代謝有關，血清中ALB的含量越高，A/G 值越大就越有利于蛋白質的沉積［14］。血清中CHOL、TG含量是衡量動物體內脂肪代謝，能反映出血栓形成、擴張血管等的重要指標［15］。CHOL是反映血液血脂方面的指標，2015年劉科等［16］對融水小型豬F1代血的生化指標檢測中發現，CHOL是反映血脂和肥胖的一種重要指標。本研究中梅山豬是地方品種豬，飼養時間長，肥胖，完全有可能導致血清中的膽固醇含量超標，兩組試驗豬的CHOL含量均超過參考值范圍，但無顯著差異（P＞0.05）。兩組GLU均偏高，但無顯著差異，這可能是由于梅山豬的品種問題，膽小應激反應大，采血應激引起。Urea是反映腎功能的指標，氣喘病組梅山豬Urea指標異常，且兩組存在極顯著差異（P＜0.01），說明氣喘病組梅山豬的腎系統功能已經開始受到影響了。CK、LDH這2個指標是反映心機功能指標［17］，本研究中兩組試驗豬這2個指標都超出參考范圍最大值，兩組的LDH指標差異顯著（P＜0.05），分析原因可能是梅山豬缺乏運動，偶爾運動或者應激會導致心機功能異常，同時，由于氣喘病組梅山豬的氣喘病，心臟加速跳動給機體其他的器官運輸血氧，LDH指標和正常組的出現顯著差異（P＜0.05）。另外，在試驗研究中，Ca、P、Na、K、Cl等微量元素指標兩組試驗豬都正常，也沒有顯著差異（P＞0.05），表明兩組試驗豬生長發育正常，不存在營養方面的問題。

3.3 梅山豬的血清免疫指標分析

免疫指標是反映動物機體健康狀態的重要指標，動物機體內血清中的抗體含量是動物健康與否的重要反映，機體內免疫因子的差異可以說明其表達分泌的分子通路存在差異［18］。IL-2、IL-4和IL-8是免疫因子，其差異是動物群體免疫力強弱的決定因素，類似的指標還有IFN-γ和TNF-α［19］。動物血液組織液等分泌液中存在一類具有抗體活性的球蛋白，這就是免疫球蛋白，免疫球蛋白有5種：IgA、IgG、IgD、IgE、IgM［20］。IgA能夠抗病毒、中和毒素和其他抗原，具有廣泛的免疫保護作用，是機體參與黏膜反應的主要效應因子［21］；IgM 是機體感染初期最早產生的抗體，在機體抗感染早期有著非常重要的作用［22］；IgG 主要是通過體液免疫阻止病原體抗原穿透過黏膜而進入動物機體組織致?。?3］。所以本研究中主要檢測IgA、IgG、IgM這3個抗體指標，來說明試驗豬的抗病能力。補體（Complement， C） ，約占血清球蛋白總量的10%，是一類具有酶活性的動物機體內的免疫球蛋白［24］，機體首先要激活C3，后續才能連續激活其他補體；C4是當機體防御外源病菌侵入時通過免疫符合作用清除病原微生物［25］。本研究中，氣喘病組梅山豬的IgA、IgG這2項指標均極顯著低于正常組，說明其抗體水平極顯著低于正常組，抵抗力相比正常組，嚴重下降。兩組試驗豬的IgM之間差異不顯著（P＞0.05），說明氣喘病組梅山豬染病已有一段時間，不是染病初期階段。IL-2、IFN-γ這2項指標方面，兩組試驗豬之間出現顯著差異（P＜0.05），也說明氣喘病組梅山豬的免疫力比正常組梅山豬弱，這可能是由于肺炎支原體已經侵入梅山豬機體內。但是，兩組試驗豬的補體水平沒有差異（P＞0.05），這點需要進一步深入研究，繼續挖掘其內在機制。

4 結論

本試驗通過對梅山豬氣喘病的生理生化、免疫指標檢測并分析發現，梅山豬氣喘病在血液常規指標中的WBC、P-LCR、NEUT、NEUT%、RDWSD、LYMPH、HCT、MONO和LYMPH%，血清生化指標中的ALT、ALP、Urea、AST，脂肪代謝指標中的LDH以及免疫指標中的IgA、IgG、IL-2和IFN- γ等指標與正常梅山豬之間有極顯著或者顯著差異，篩選抗氣喘病梅山豬可以重點參考并篩查以上這些指標相關的基因及其表達情況。