基于稻瘟病菌毒性基因的穗頸瘟抗性鑒定菌系篩選與應用

蘭 波，陳 建，陰長發，李湘民，楊迎青

（江西省農業科學院 植物保護研究所，江西 南昌 330200）

水稻稻瘟病是一種世界性的重要真菌病害，在病害流行的年份嚴重影響水稻產量和稻米品質，嚴重地區甚至顆粒無收［1］。選育和利用抗病水稻品種是防治稻瘟病最有效的措施，但稻瘟病菌生理小種不斷變化且變異較快，育成的抗病水稻品種通常在種植3～5年后極易喪失抗性［2］。因此，稻瘟病抗性鑒定工作對水稻品種的安全布局來說是一項極其重要的工作，只有在水稻育種的源頭明確水稻品種的抗性，才能在實際生產中選擇抗性好的品種，減少稻瘟病造成的損失［3］。

稻瘟病抗性鑒定主要有田間自然誘發鑒定與室內人工鑒定這2種方法，田間自然誘發鑒定的稻瘟病菌更符合當地菌群的實際情況，且操作簡單實用，但該方法往往由于當年氣候環境等因素而影響鑒定結果的準確性；而室內稻瘟病鑒定相對可以人為地控制溫度、濕度等稻瘟病發病條件，從而充分保證抗性鑒定結果的準確性，但室內稻瘟病鑒定的一個關鍵因素是稻瘟病菌的選擇，鑒定菌株的篩選必須能夠代表某一地區菌群的組成情況，這樣才能真實地測定水稻品種在該地區的抗性水平。因此有效地篩選具有代表性的鑒定菌系是稻瘟病抗性鑒定特別是穗頸瘟抗性鑒定成功的關鍵。我國學者根據當地實際情況選擇不同的稻瘟病抗性鑒定方法開展了水稻種植品種或抗病資源品系稻瘟病的抗性鑒定，為當地篩選并獲得了豐富的抗病品種（系）。郝中娜等［4］采用人工接種和自然誘發鑒定方法鑒定了2013～2017年我國長江中下游稻區水稻品種區域試驗的800個秈稻參試品種的稻瘟病抗性。鄢圣敏等［5］利用自然病圃誘發鑒定了9283份水稻品種的稻瘟病抗性，并發現供試材料的葉瘟與頸瘟表現呈顯著正相關。李湘民等［6］采用生態多點分批播種法、離體穗段點滴接種法、活體穗苞注射接種法這3種稻瘟病抗性鑒定方法評價了江西省種植面積較大且抗性差異較明顯的9個早稻品種的抗性水平。

傳統的稻瘟病抗性鑒定菌株篩選是通過苗期接種某些水稻鑒別品系后的抗致病型來確定的，但到目前為止還沒有一套統一的稻瘟病菌鑒別寄主，這為抗性鑒定菌系的選擇帶來了困難。早在1961年日本學者根據各水稻品種對稻瘟病菌株的反應型確立了第一套稻瘟病菌小種鑒別品種［7］。在20世紀60年代中期，美、日兩國合作研究篩選出一套由8個秈、粳稻品種組成的國際鑒別品種，但其抗性基因組成不明且小種鑒別力低因而未得到廣泛應用［8］。在20世紀70年代，日本學者山田等［10］根據Flor［9］的基因對基因學說，篩選出一套基于抗性基因分析的9個粳稻“單基因”鑒別品種。我國學者于1980年篩選出特特普、珍龍13、四豐43、東農363、關東51、合江18和麗江新團黑谷（LTH）等7個水稻品種作為中國稻瘟病菌小種鑒別品種，但因其抗性基因組成不明，小種鑒別力低，在國內特別是北方粳稻區的應用受到局限［11-12］。凌忠專等［13-14］以普感品種麗江新團黑谷（LTH）為輪回親本，選育出6個單基因近等基因系（LTH-NIL）。2000年，IRRI與日本國際農業科學研究中心（JIRCAS）合作，將24個稻瘟病抗性基因導入到LTH背景，育成31個單基因系（LTH-monogenic lines，LTH-MLs）［15-16］。前期研究報道的抗性鑒定菌株篩選都是在苗期接種以鑒別寄主反應型來確定的，其對穗頸瘟抗性是否具有較好的鑒定能力卻無法確定。目前還沒有直接證據證明水稻對苗（葉）瘟的抗性與穗頸瘟的抗性具有正相關性。由于稻瘟病菌的毒性主要由致病基因與無毒基因控制，本研究通過特異性引物標記測定區域稻瘟病菌群的致病基因與無毒基因情況，根據測定結果聚類劃分成不同的遺傳宗譜，再從不同的宗譜中按比例篩選菌株，組成代表該地區稻瘟病菌群的抗性鑒定菌系。通過田間自然誘發鑒定驗證其鑒定結果，表明該方法具有高效、準確、省時省力的特點，在水稻稻瘟病特別是穗頸瘟的抗性鑒定方面有很大的應用潛力。

1 材料與方法

1.1 稻瘟病標本的采集

在江西婺源（贛東北）、都昌（贛北部）、豐城（贛中）、井岡山（贛西南）、萬安（贛南）這5個地區稻瘟病自然病圃種植高感品種麗江新團黑谷，在半黃熟期采集稻瘟病發病標樣，用牛皮紙袋裝好，記錄好標樣的采集地點、時間、寄主品種、采集人等信息。

1.2 稻瘟病菌單孢菌的分離、保存

取采集的稻瘟病標樣剪成寸許，浸水18～24 h，待充分吸水后，用清水沖洗2～3次，再用滅菌水沖洗一次，放入墊有U形玻璃棒的保濕培養皿中，置于28 ℃恒溫培養箱內暗培養2 d，觀察到標樣上有灰色或灰綠色的孢子后，采用眉毛挑單孢法，將病部置于眉毛挑單孢顯微鏡下，挑取單個孢子在PDA斜面培養基中培養。純培養后轉接到放有滅菌濾紙片的PDA培養基培養，待濾紙片長滿菌絲，將菌絲挑出在無菌的羊皮紙袋中，置于-80 ℃超低溫冰箱保存（圖1）。本研究從同一地區分離保存了189個稻瘟病菌單孢菌株，編號為WY1～WY189。

圖1 稻瘟病菌濾紙片保存

1.3 稻瘟病菌DNA的提取

將分離保存的稻瘟病菌株活化后，挑取適量菌絲接種到 PDA液體培養基中，置于120 r /min的搖床上28 ℃培養3～6 d，待菌絲體有一定量后用滅菌紗布過濾收集、烘干,于-20 ℃保存備用。之后將收集的菌絲體分裝于2 mL的Eppendorf管中，加2顆5 mm滅菌碳鋼珠后迅速加65 ℃預熱的CTAB提取液，應用全自動樣品快速研磨儀進行磨樣，按照天根植物基因組提取試劑盒TIANGEN（DP350）說明書中的提取方法對病菌基因組的DNA進行提取，于-20 ℃冰箱保存備用。

1.4 稻瘟病菌無毒基因與致病基因測定

選用已公開報道且克隆的8個稻瘟病菌致病基因與8個無毒基因作為檢測目的基因，8個稻瘟病菌致病基因分別為MPG1、MPS1、MagB、CPKA、MNH1、MgYCA1、MgS11、MgATG5，8個稻瘟病菌無毒基因分別為Avr-pia、Avr-pit、Avr-pik、Avr-pi-ta、Avr-pizt、Avr-co39、ACE1、PRE1。

根據以上基因序列設計特異性引物標記（表1）［17-19］。PCR總反應體系為20 μL，包括DNA模板1 μL（≤200 ng）、0.2～0.4 μmol/L正、反 向 引 物各1 μL、2.5 mmol /L dNTP 0.5 μL、Taq DNA聚合酶 0.2μL、10×Buffer（含Mg2+）2 μL，ddH2O 14.3 μL。PCR反應程序： 95 ℃預變性5 min； 94 ℃變性30 s，55～57 ℃（按引物設定溫度）退火1 min，72 ℃ 延伸60～90 s （根據片段大小而定），共35個循環； 最后72 ℃延伸 10 min。將獲得的PCR產物保存于4 ℃冰箱，用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，最后在凝膠成像系統的紫外燈下拍照保存。

表1 稻瘟病菌致病基因與無毒基因分子檢測引物序列

1.5 聚類分析與穗頸瘟抗性鑒定菌系的確定

根據PCR擴增條帶的結果，有條帶則記為“1”，無條帶則記為“0”，構建基于SSR的“0-1”數據庫；應用NTSYS數據處理系統計算遺傳距離，以菌株DNA擴增條帶的位置相似水平為基準，用最長距離法對菌株群體遺傳多樣性進行聚類分析。通過聚類可以將菌株歸類成不同的密切相關的組，每一組稱為一個遺傳宗譜；根據不同的相似系數可以劃分成不同數量的遺傳宗譜。將每個宗譜菌株占總菌株的百分比作為在抗性鑒定菌系中的百分比，隨機挑選菌株組成穗頸瘟抗性鑒定菌系。

1.6 穗頸瘟抗性鑒定

室內離體接種鑒定：待抗性鑒定菌系確定后，將供試的10個不同抗性水平的水稻材料在大田正常栽培，待長至孕穗破口初期，從田間每一品種的小區內剪取20個穗長露出1～2 cm的稻穗，帶回實驗室，剪取長約7～8 cm長的穗段（穗頸節上部2 cm，下部5～6 cm），然后將4根穗段放入鋪有雙層過濾紙的培養皿內（每皿加2 mL的無菌水），用移液器在每根穗段的穗頸節位點及節下約4 cm處各滴入5 μL的孢子懸浮液。將培養皿放入26 ℃的光照培養箱中，并用透明的薄膜包被，以保持培養皿內的濕度。光暗交替培養10～12 d。離體接種培養12 d后，檢查各培養皿穗頸的發病情況，分級標準如下：0級：無病斑；1級：病斑長度不超過5 mm；3級：病斑長度6～15 mm；5級：病斑長度超過16 mm，但病斑間不相連；7級：病斑相互連接，大部分穗段發??；9級：病斑相互連接，80%以上穗段發病。將平均病級小于1的定為抗??；在1～3之間的定為中抗；在3～5之間的定為中感；在5～7之間的定為感??；大于7的定為高感?？剐灶l率（%）=（抗病菌株數/總菌株數）×100%。

自然病圃鑒定：將10個供試水稻品種按正常田間操作種植在抗性鑒定菌系來源地區大田，在種植過程中不施殺菌劑，待長至半黃熟期時隨機調查每個品種的31個穗，計算平均病級（按國家稻瘟病穗頸瘟分級標準調查）以及病穗率。病穗率（%）=（發病穗數/總穗數）×100%。

2 結果與分析

2.1 稻瘟病菌毒性相關基因分子檢測結果

采用16對特異性引物標記檢測包括8個稻瘟病菌無毒基因與8個致病基因共16個稻瘟病毒性相關基因在供試的189個稻瘟病菌中的分布情況，并計算每個基因在所有菌株中的檢測頻率。檢測結果（圖2、圖3）顯示，16個稻瘟病菌毒性相關基因在江西稻瘟病菌中的檢測頻率為0%～96.29%，存在顯著差異，其中最高檢測頻率的基因是MPG1，為96.29%，最低的是MNH1，為0%。結果表明江西稻瘟病菌遺傳結構較為復雜，存在多種不同的致病類型。

圖2 稻瘟病菌毒性相關基因的分子檢測頻率

圖3 部分稻瘟病菌無毒基因與致病基因的分子檢測結果

2.2 稻瘟病菌毒性相關基因分子測定結果聚類分析

根據 PCR 擴增條帶的結果構建基于SSR的“0-1”數據庫，用最長距離法對菌株群體遺傳多樣性進行聚類分析。通過聚類結果（圖4）可知，不同的相似系數可以將江西稻瘟病菌劃分成不同的遺傳宗譜單元，本研究確定在相似系數0.75時供試的稻瘟病菌株劃分成的遺傳宗譜數較為合理，聚類結果顯示，在相似系數0.75時供試的189個稻瘟病菌株被聚類成7個遺傳宗譜（表2）。其中優勢宗譜為L1與L4，菌株占比分別為21.69%與63.49%；其他5個宗譜為小宗譜或稀有宗譜。

圖4 稻瘟病菌致病基因與無毒基因分子檢測結果的聚類結果

表2 遺傳相似系數0.75水平下稻瘟病菌的遺傳宗譜聚類結果

2.3 稻瘟病抗性鑒定菌系的確定

根據上述聚類結果，初步確定稻瘟病抗性鑒定菌系總菌株數為20個，挑選菌株的原則：將每個宗譜的稻瘟病菌株占所有菌株的百分比作為菌系中各宗譜菌株所占的百分比，隨機挑選菌株；如果宗譜總菌株數與百分比的乘積小于1，則只挑選1個作為鑒定菌株；其他宗譜按照宗譜菌株數與其占比確定篩選鑒定菌株數。本研究確定的20個稻瘟病菌株組成的抗性鑒定菌系包括L1宗譜3個、L2宗譜1個、L3宗譜1個、L4宗譜12個、L5宗譜1個、L6宗譜1個、L7宗譜1個（表3）。

表3 稻瘟病抗性鑒定菌系的篩選結果

2.4 抗性鑒定菌系室內穗頸瘟抗性鑒定結果驗證

利用篩選到的20個抗性鑒定菌系，在室內采用離體穗段點滴接種法與田間自然病圃誘發鑒定2種方法對10個水稻品種進行穗頸瘟抗性鑒定。結果（表4、圖5）顯示：源豐A、昌A、泰香A、蓮CS、昌香A、33S靚占、望S靚占、兩優靚占、九香粘、唐S靚占這10個供試品種利用本研究篩選的抗性鑒定菌系鑒定穗頸瘟的結果分別為中感、感病、感病、中抗、抗病、高感、中感、感病、高感、抗病，與田間自然誘發鑒定結果的表現完全一致。鑒定結果表明利用本研究篩選的稻瘟病鑒定菌系對水稻品種的穗頸瘟抗性鑒定準確度高。

圖5 抗性鑒定菌系室內離體穗頸瘟抗性鑒定結果

表4 抗性鑒定菌系室內鑒定與田間自然誘發鑒定的結果比對驗證

3 討論

利用抗病品種防治稻瘟病是目前最經濟有效的方法，但隨著抗病品種大面積的持續推廣，田間稻瘟病菌生理小種在寄主品種定向選擇的壓力下會不斷變異產生新的致病小種，從而致使抗病品種的抗性喪失。另一方面，單一水稻品種的大面積連續推廣也會改變當地的生理小種結構以及優勢生理小種種群，因此為克服稻瘟病菌生理小種變異帶來的病害流行，需要不斷篩選新的抗病品種并加以推廣應用。水稻品種的推廣應用、稻種遺傳資源的評價、抗病基因的發掘和利用等均需要一套長期穩定且具有代表性的稻瘟病菌鑒別體系。

室內人工稻瘟病抗性鑒定相較于自然病圃抗性鑒定具有多方面的優點，目前多采用水稻苗瘟期鑒定。而用于抗性鑒定的菌株篩選最早是通過接種鑒別品系的抗感反應來劃分類群，但這種方法由于受接種環境與操作人員素質的影響較大，結果會出現一定的偏差。本研究中的方法是基于稻瘟病菌本身遺傳基因水平上的差異，通過特異性分子標記技術測定與稻瘟病菌毒性相關的一些基因的存在或缺失，根據測定結果進行聚類，從中篩選一套與當地稻瘟病菌群組成結構一致的代表性鑒定菌系并應用于水稻品種的稻瘟病抗性鑒定。從實際應用效果來看，從江西省5個具有代表性的不同地理生態型病圃分離篩選20個菌株組成的江西稻瘟病抗性鑒定菌系，在室內離體接種穗頸段測定當地10個抗性不同的水稻種質資源品種的穗頸瘟抗性水平，其結果與田間自然誘發鑒定的結果基本一致，抗性水平的劃分也完全屬于同一級別。因此，本研究基于稻瘟病菌毒性相關基因篩選的稻瘟病抗性鑒定菌系是可行的，其鑒定準確度高，在稻瘟病抗病育種與抗病品種篩選等方面應用前景廣闊。

菌株的來源是稻瘟病抗性鑒定代表菌系構建成功與否的關鍵。本研究是從江西省5個代表性地區的稻瘟病自然病圃采集發病標本分離菌株，通過分子測定毒性相關基因篩選稻瘟病抗性鑒定菌系。然而由于稻瘟病菌的致病性分化嚴重以及易變性的特點，在后續研究中需要從更多地區采集標本分離菌株，不斷更新和補充已篩選構建的稻瘟病抗性鑒定菌系，從而保證抗性鑒定結果的準確性。