灌漿期小麥旗葉在高溫脅迫下的轉錄組分析

劉秀坤，韓冉，李曉明，解樹斌，李法計，陳亞鵬，翟勝男，李豪圣，劉建軍，趙振東，張玉梅，曹新有

(1.青島農業大學農學院，山東 青島 266109；2.山東省農業科學院作物研究所/小麥玉米國家工程中心/農業部黃淮北部小麥生物學與遺傳育種重點實驗室/山東省小麥技術創新中心，山東 濟南 250100；3.山東魯研農業良種有限公司，山東 濟南 250100；4.滕州市農業農村局，山東 滕州 277599)

小麥是我國第二大糧食作物[1]，2010—2019年平均種植面積在2400萬公頃左右。小麥具有較高的營養價值和特殊的面筋特性，可用于多種食品的加工，為人類提供21%的食物熱量和20%的蛋白質[2]。

小麥是喜涼作物，日均溫20～24℃最適合其籽粒灌漿，超過30℃會對籽粒灌漿和品質造成影響[3]。研究表明，灌漿期高溫天氣頻發會使小麥灌漿速率降低[4]，灌漿時間縮短[5]，造成小麥籽粒灌漿不充分，降低小麥產量；全球氣溫每上升1℃，小麥減產6%[6]。根據濟南市氣象局的溫度記錄，2017—2021年間小麥灌漿期日均溫在27～30℃，最高可達35℃，這不僅會降低小麥產量，還會對小麥品質造成影響[7]。麥谷蛋白含量與醇溶蛋白含量的比值影響小麥的面筋特性，灌漿中后期高溫，麥谷蛋白含量降低，醇溶蛋白含量增加，使麥谷蛋白含量與醇溶蛋白含量比值減小，降低面筋強度[8]。與此同時，灌漿期溫度超過30℃，會使小麥淀粉含量降低，面團強度下降，影響其加工品質[9]。

植物在生長發育過程中往往會遭受諸多非生物因素脅迫，如鹽堿、低溫、干旱、高溫等，這些非生物脅迫會使代謝過程紊亂，致使細胞內活性氧(ROS)積累，影響植物正常的生長發育[10]。目前，植物抵御高溫脅迫的機理研究已取得了較大進展，與耐熱相關的基因也在陸續挖掘和驗證。田雪軍在小麥中發現了2個耐熱基因——TaMBF1c和TaMYB85，熱脅迫條件下，TaMBF1c的缺失突變體在微管運輸、脅迫響應、蛋白質加工代謝等途徑中相關基因的翻譯效率降低，而過表達TaMBY85基因的擬南芥和小麥耐熱性提高[11]。高溫脅迫會促進植物體熱激蛋白(heat shock protein)的轉錄和翻譯，而熱激蛋白具有維持細胞結構穩定和正常生理功能的作用。Montero-Barrientos等研究表明，轉哈氏芽孢桿菌hsp70基因的擬南芥表現出了更高的耐熱性，且植株生長并沒有受到抑制，在經過高溫預處理后表現出了更好的抵御逆境脅迫的能力[12]。Katiyar-Agarwal等將擬南芥基因Athsp101導入水稻中，轉基因水稻表現出更高的耐熱能力，高溫脅迫后產量沒有顯著下降[13]。在受到熱脅迫后，小麥熱激轉錄因子TaHsfA1能促進熱激蛋白的表達，提高擬南芥幼苗的耐熱性[14]。因此，明晰耐熱調控網絡，挖掘耐熱相關基因，利用分子育種等手段選育耐熱品種，對提高小麥耐熱性具有重要意義。

本試驗以本課題組前期研究中篩選到的小麥耐熱品種菏麥13和熱敏感品種臨麥2號[15]為試材，經熱脅迫處理，運用RNA－seq技術對灌漿期旗葉進行轉錄組分析，以挖掘熱脅迫相關基因，為后續進一步研究耐熱脅迫調控網絡、選育耐熱新品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究選用耐熱品種菏麥13和熱敏感品種臨麥2號為材料，于2018年10月中旬正常播種于埋置在大田的花盆中，每盆10粒，按大田常規管理，待出苗后間苗，每盆留5株。每份材料種4盆。

1.2 樣品處理及分類

花后14 d，將4盆材料(2盆菏麥13和2盆臨麥2號)移至人工氣候箱，42℃處理0、1 h，剩余4盆留至原處作為對照。取主穗同等部位的旗葉于－80℃冰箱保存。所取樣品按照以下方案進行分類，用于后續的RNA－seq及分析。

表1 樣品分類及差異分析對比方案

1.3 文庫構建及測序

提取樣品總RNA并使用DNaseⅠ消化DNA后，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA，向得到的mRNA中加入適量打斷試劑，高溫條件下使其片斷化，再以片斷后的mRNA為模板，合成cDNA，經過磁珠純化、末端修復、3′末端加堿基A、加測序接頭后，進行PCR擴增，從而完成整個文庫制備工作。構建好的文庫用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real－Time PCR System進行質量和產量檢測，文庫質控合格后進行測序。

1.4 原始數據過濾統計及質量分析

應用base calling將測序得到的數據轉化成序列信息，為了保證信息分析的可靠性，需對數據進行一系列的處理:去除含adapter的reads，去除含N比例大于10%的reads，去除低質量的reads(從整體上，Q≤20的堿基比例較低表明測序質量較好)，從而獲得clean reads。

1.5 差異基因的篩選

基于泊松分布分析方法，通過控制FDR(錯誤發生率)，根據表達量(FPKM值)計算基因在不同樣本間的差異表達倍數，以FDR≤0.001、≥2為標準篩選兩樣本間的差異基因。

1.6 轉錄表達譜qRT－PCR驗證

為了驗證轉錄組數據的可靠性，需要對差異表達基因進行熒光定量PCR驗證。我們隨機選取了20個差異表達基因進行qRT－PCR驗證。利用Primer Premier 5軟件進行引物設計(表2)。

表2 qRT－PCR引物

2 結果與分析

2.1 測序質量分析

從整體上看，樣本的CG含量在53.34%～55.08%之間，Q20比例在98.95%以上，Q30比例在96.26%以上(表3)。說明樣本的質量較好，可用于下一步分析。

表3 轉錄組測序數據統計

2.2 差異基因的篩選結果

最終4個對比方案共獲得4715個差異基因(圖1)。臨麥2號葉片0 h－vs－臨麥2號葉片1 h檢測出1527個差異表達基因，菏麥13葉片0 h－vs－菏麥13葉片1 h檢測出1190個差異表達基因，說明小麥旗葉中某些基因對高溫脅迫做出響應，在高溫條件下表達。臨麥2號葉片0 h－vs－菏麥13葉片0 h檢測到1225個差異表達基因，臨麥2號葉片1 hvs－菏麥13葉片1 h檢測到773個差異表達基因，說明在高溫脅迫下某些基因會沉默，不表達。

圖1 樣品差異表達基因統計

2.3 轉錄表達譜qRT－PCR驗證

隨機選擇20個耐熱基因進行qRT－PCR驗證(圖2)，其中11個上調表達，如與逆境脅迫相關基因Rps7和Snf1、熱脅迫相關基因MADS等；9個下調表達，如氧化脅迫相關基因Beta－carotene hydroxylase、核小體蛋白亞基H2B等。qRT－PCR驗證結果表明表達趨勢與RNA－seq測序分析結果一致，證明了RNA－seq測序結果的可靠性和可重復性，也為下一步確定候選基因并進行深入研究提供了參考。

圖2 差異基因的qRT－PCR驗證

2.4 差異基因GO顯著富集分析

將獲得的目的基因進行GO富集分析，主要從基因的分子功能(molecular function)、所處的細胞位置(cellular component)、參與的生物過程(biological process)三部分分析差異表達基因的生物學功能(圖3)。4個對比方案中，生物過程主要富集在代謝過程、細胞過程、單體過程、定位和刺激反應，細胞組分部分主要富集在細胞、細胞組分、細胞器、細胞器組分、膜、膜組分和高分子復合物，分子功能部分主要富集在結合物和催化活性。

圖3 差異基因GO功能富集分析

2.5 差異表達基因的KEGG注釋及通路分析

通過對差異表達基因的通路注釋可以進一步解釋基因的生物學功能，對4715個差異表達基因進行KEGG分析，選取顯著富集的前20個通路繪制散點圖(圖4)。臨麥2號葉片0 h－vs－臨麥2號葉片1 h之間差異顯著富集的通路主要在內質網蛋白質加工、氧化磷酸化、內吞作用、剪接體、核糖體、光合作用、氮代謝、谷胱甘肽代謝，臨麥2號葉片0 h－vs－菏麥13葉片0 h之間差異顯著富集的通路主要在谷胱甘肽代謝、苯并惡嗪酮類化合物生物合成、二羧酸代謝、檸檬烯和蒎烯降解、維生素B6代謝、油菜素內酯的生物合成、二苯酚、二甲苯和姜二醇生物合成、次生代謝產物的生物合成、異黃酮的生物合成、亞麻酸代謝、甘油磷脂代謝、苯丙素的生物合成、自然殺傷細胞介導的細胞毒性、色氨酸代謝，臨麥2號葉片1 h－vs－菏麥13葉片1 h之間顯著富集的通路主要在代謝途徑、光合作用、氧化磷酸化、二羧酸代謝、谷胱甘肽代謝、亞麻酸代謝、油菜素內酯的生物合成，菏麥13葉片0 h－vs－菏麥13葉片1 h之間差異顯著富集的通路主要在內質網蛋白質加工、內吞作用、剪接體、異黃酮生物合成、光合作用、氧化磷酸化、檸檬烯和蒎烯降解、二萜生物合成、核苷酸切除修復、亞油酸代謝、錯配修復、DNA復制。

圖4 差異基因KEGG富集通路

2.6 差異表達基因的轉錄因子

對所有差異表達基因歸類，發現轉錄因子共有86個(表4)，屬于21個轉錄因子家族，主要包含AP2－EREBP家族15個(上調10個，下調5個)，MYB家族11個(上調4個，下調7個)，NAC家族8個(上調4個，下調4個)，WRKY家族12個(上調5個，下調7個)，HSF家族7個(上調7個)。

表4 差異表達基因轉錄因子數目統計

3 討論與結論

植物對高溫的響應是多基因控制的過程，為了明確小麥在全基因組水平上對高溫的響應機制，本研究采用高通量測序技術，對耐高溫小麥品種菏麥13和熱敏感品種臨麥2號在花后14 d 42℃高溫處理0、1 h，取旗葉進行轉錄組測序分析，Q30比例在96%以上，表明測序質量良好，保證了數據的可靠性，可以進行后續分析。本研究共篩選出4715個差異表達基因，其中上調表達基因數目為3040個，下調表達基因數目為1675個。

3.1 不同品種在熱脅迫下差異基因的GO分析

通過差異表達基因的GO富集分析可知，4個比較方案在參與的生物過程和所處細胞位置方面主要富集在代謝過程和細胞。在高溫處理1 h后，臨麥2號葉片0 h－vs－臨麥2號葉片1 h、菏麥13葉片0 h－vs－菏麥13葉片1 h中刺激反應富集的基因數目明顯較臨麥2號葉片0 h－vs－菏麥13葉片0 h多，說明某些基因在高溫條件下開始表達，對逆境做出響應。在分子功能方面，臨麥2號葉片0 h－vs－臨麥2號葉片1 h和菏麥13葉片0 h－vs－菏麥13葉片1 h結合物富集基因較多，臨麥2號葉片0 h－vs－菏麥13葉片0 h和臨麥2號葉片1 h－vs－菏麥13葉片1 h則是催化活性富集較多，表明高溫脅迫下，基因以結合物的形式參與調控。臨麥2號葉片1 h－vs－菏麥13葉片1 h在膜上富集的基因數目較臨麥2號葉片0 h－vs－臨麥2號葉片1 h少了許多，這可能是耐熱品種與不耐熱品種之間的差異。

3.2 不同品種在熱脅迫下差異基因的KEGG分析

在KEGG 4種比較方案的分析中，臨麥2號葉片0 h－vs－臨麥2號葉片1 h和菏麥13葉片0 h－vs－菏麥13葉片1 h的差異基因顯著富集的通路主要集中在內質網蛋白質加工、內吞、光合作用、谷胱甘肽代謝、剪接體等方面。光合作用發生次數最多，表明高溫對光合作用的影響最大。光合速率的降低會阻礙同化物的運輸，降低淀粉合成速率，導致小麥籽粒干癟，千粒重減少，從而影響產量[1]。當高溫脅迫發生時，植物的耐高溫機制開始響應，如熱激蛋白和熱激轉錄因子開始參與高溫脅迫，內質網蛋白質加工得到加強。內吞作用是鈣離子進入細胞的途徑之一，鈣離子在抵抗高溫脅迫方面也起著重要作用。有研究表明，在小麥葉片上噴灑一定濃度的CaCl2溶液可以有效提高小麥的耐熱性，提高小麥產量[17]。谷胱甘肽參與誘導多種熱激蛋白的表達，例如谷胱甘肽通過轉錄因子MYB21激活熱休克蛋白基因bip3和hsp70b啟動子，通過轉錄因子BZIP10激活hsp90.1啟動子[18，19]。

3.3 部分轉錄因子對熱脅迫的響應

轉錄因子是細胞響應外界脅迫以后主要調控某些基因轉錄的調控因子。朱丹等[20]以薄荷為試驗材料，在光照培養箱設置40℃模擬高溫脅迫處理2 h，采集葉片進行高通量測序，其結果顯示與高溫脅迫相關的轉錄因子家族主要集中在NAC、AP2－EREBP、WRKY、MYB、HSF等轉錄因子家族；張春霄[21]在黃花苜蓿中克隆到AP2/EREBP家族的MfERF049基因，對該基因進行了高溫、低溫、干旱、耐鹽等非生物脅迫且該基因對上述非生物脅迫做出響應。李靜宇等[22]證實MYB基因上啟動子區域含有多種脅迫和生物激素的響應元件。NAC轉錄因子家族在調控包含高溫在內的多種非生物脅迫時起到了非常重要的作用[23，24]。WRKY是植物中特有的一類轉錄因子家族，具有一個或兩個WRKY結構域[25]，與種子的休眠和萌發、作物的衰老和抵御逆境脅迫有關。HSF轉錄因子家族在對高溫的響應中一直發揮著重要作用[26，27]。本研究結果發現在高溫脅迫下，小麥旗葉中的轉錄因子包括NAC、AP2－EREBP、WRKY、MYB、HSF。這與前人結果一致，表明這些轉錄因子在小麥應對高溫脅迫時發揮重要作用。該結果為后續探索小麥高溫脅迫的分子機制及選育優質的耐高溫品種提供理論依據。