玉米ZmGly3基因的生物信息學與表達特性分析

于秋鴻，曾黎，宋希云，李軍

(青島農業大學農學院，山東 青島 266109)

干旱和鹽漬是制約作物產量、品質和農業可持續發展的重要影響因素[1]。研究表明，在遭受干旱、鹽脅迫等逆境時，植物細胞會積累過量的甲基乙二醛(methylglyoxal，MG)[2，3]。MG在低濃度下可作為一種信號分子，參與種子萌發、根發育、莖形態發生、細胞凋亡和脅迫耐受等多種生物學過程[4－8]，但在高濃度下對細胞內的多種成分(如蛋白質、DNA、RNA和脂質)具有高度反應活性，導致它們不可逆地修飾或形成交聯復合物，引發細胞毒害[9]。

乙二醛酶系統(Gly1、Gly2和Gly3)在MG的降解清除中發揮著極為重要的作用。Gly1和Gly2需要還原型谷胱甘肽(GSH)作輔助因子將MG降解為無毒的乳酸，而Gly3可以不依賴GSH的協助完成對MG的直接降解[10]。目前普遍認為Gly1－Gly2途徑在MG降解過程中是最有效的，如過表達Gly1和Gly2的轉基因煙草、水稻和擬南芥均表現出較強的耐鹽和抗旱能力[11－14]。但Gly1－Gly2途徑需要GSH和金屬離子作為其活性的輔助因子，因此當GSH不足時，Gly3才能在MG降解中發揮作用[2]。Gly3廣泛存在于大腸桿菌[15]、裂殖酵母[16]和真核生物[17，18]中。已有證據表明，Gly3也可參與植物對生物和非生物逆境的應答[10，18－20]。

玉米是一種重要的糧飼兼用作物，生長過程中經常遭受干旱脅迫，而且近年來因全球氣候變暖導致的熱旱害日趨嚴重[21]。土壤鹽漬化也在一定程度上限制了玉米的種植和推廣。為此，我們從NCBI網站(https://preview.ncbi.nlm.nih.gov)檢索到了玉米Gly3蛋白的編碼基因(命名為ZmGly3)，利用生物信息學和分子遺傳學方法對ZmGly3的編碼蛋白理化性質、空間結構和表達時空特異性等進行解析，以期找出該基因在玉米應答干旱和鹽脅迫中的作用，為玉米抗旱耐鹽育種提供可用的基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理方法

供試玉米品種為鄭單958。將種子播于含有營養土和蛭石(體積比為3∶1)的花盆中，每盆1粒，置于青島農業大學智能溫室內(25℃)培養；待幼苗長至三葉期時分別用20% PEG600和125 mmol/L NaCl溶液進行模擬干旱和鹽脅迫處理，每處理5株幼苗，重復3次。分別于處理0、12、24、48 h后選取玉米幼苗的根、莖和葉，快速置于液氮中，于－80℃保存備用。

1.2 試劑

RNA提取試劑盒購自TaKaRa公司；反轉錄試劑盒和熒光定量試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；引物由北京擎科生物科技有限公司合成(表1)。

表1 qRT－PCR引物

1.3 生物信息學分析

從NCBI網站(https://preview.ncbi.nlm.nih.gov)檢索到ZmGly3(登錄號NM＿001153455.1)；用ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam)軟件分析ZmGly3編碼蛋白的理化性質；用TMHMM Server 2.0軟件進行蛋白跨膜結構預測；用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr)和SWISS－MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)進行蛋白質高級結構分析；用MEGA 7.0軟件對ZmGly3進行系統進化樹分析。

1.4 總RNA提取、cDNA合成和表達模式分析

按照RNA提取試劑盒操作說明提取總RNA；用反轉錄試劑盒合成cDNA；用qRT－PCR分析表達模式，以Actin作為內參基因。

2 結果與分析

2.1 ZmGly3的理化性質分析

用ProtParam tool軟件分析發現，ZmGly3全長cDNA序列為1164 bp，編碼387個氨基酸，理論分子量為41.2 kD，等電點為5.37。對氨基酸組成分析發現，帶負電荷的氨基酸(Asp＋Glu)殘基總數為43，帶正電荷的氨基酸(Arg＋Lys)殘基總數為31；Ala含量最高，占11.9%；Trp含量最少，占0.9%。蛋白不穩定系數較低，為31.70，屬于穩定蛋白。用ProtScale分析發現，此蛋白整體為親水性蛋白，在第127個氨基酸殘基處的數值為2.38，疏水性最高，在第251個氨基酸殘基處的數值為－2.344，親水性最高(圖1a)。TMHMM Server分析發現，該蛋白不含跨膜結構域(圖1b)，為細胞質蛋白。用CD－Search分析發現，ZmGly3含有兩個DJ－1/Pfp1結構域，屬于谷氨酰胺氨基轉移酶(GAT－1)超家族(圖1c)。

圖1 ZmGly3蛋白的親、疏水性(a)、跨膜結構域(b)和保守區(c)分析

2.2 ZmGly3的結構分析

用SOPMA軟件分析發現，ZmGly3蛋白的二級結構主要有α－螺旋、延伸鏈、β－折疊和無規則卷曲。其中，α－螺旋有124個氨基酸，占32.04%；延伸鏈有83個氨基酸，占21.45%；β－折疊有39個氨基酸，占10.08%；無規則卷曲有141個氨基酸，占36.43%(圖2a)。用SWISS－MODEL軟件分析發現，ZmGly3蛋白由三條鏈組成，無金屬結合位點(圖2b)。

圖2 ZmGly3蛋白的二級結構(a)和空間結構(b)

2.3 系統進化樹分析

用BLAST程序從NCBI數據庫中檢索了與ZmGly3蛋白同源的其他植物的氨基酸序列，選取氨基酸序列同源性≥60%的10種植物進行進化樹分析。結果表明，ZmGly3蛋白與馬蹄芒MlGly3同源性為95.09%，親緣關系最近；與茶樹CsGly3同源性為79.53%，親緣關系最遠(圖3)。

圖3 ZmGly3同源序列比對和系統進化樹分析

2.4 ZmGly3組織特異性表達

在正常生長條件下，ZmGly3在玉米根、莖和葉中均有表達，但在莖中最高，葉中次之，根中最低(圖4)。莖中ZmGly3的相對表達量分別是根和葉中表達量的7.2倍和2.9倍。

圖4 ZmGly3在玉米不同器官中的相對表達量

2.5 ZmGly3在干旱和鹽脅迫下的表達

在干旱脅迫下，ZmGly3在玉米幼苗根中的相對表達量隨處理時間的延長呈現先升高后降低的趨勢，處理24 h相對表達量達到最高值，是對照(0 h)的3.6倍；干旱脅迫降低ZmGly3在莖中的相對表達量，處理48 h的相對表達量僅為對照的70%；在葉中的相對表達量總體呈現升高趨勢，處理48 h的相對表達量最高，是對照的2.2倍(圖5a)。鹽脅迫能促進ZmGly3在玉米幼苗根、莖、葉中的相對表達量，且均隨處理時間的延長呈現先升高后降低的趨勢，均在處理24 h達到最高值，分別是對照的2.0、1.3、1.8倍(圖5b)。

圖5 ZmGly3在干旱(a)和鹽(b)脅迫下的相對表達量

3 討論與結論

Gly3參與的MG降解途徑可以被認為是細胞內GSH不足或匱乏時清除過量MG的替代途徑。Gly3的標志性特征是具有DJ－1/PfpI結構域，該結構域中保守的His－Cys－Glu/Asp是酶的活性位點，有MG降解活性但缺乏對GSH的結合親和力；當Cys119定點突變為丙氨酸時，Gly3活性顯著降低[2，17]。Gly3普遍存在于從低等(苔蘚、石松)到高等(裸子、被子)的植物中[17]。另外，Gly3蛋白主要定位于細胞核、細胞質和葉綠體中[3，22]。我們利用生物信息學方法分析了玉米Gly3(ZmGly3)蛋白的理化性質和結構特點，結果表明，ZmGly3含有387個氨基酸，為穩定的親水性蛋白；含有兩個DJ－1/Pfp1結構域，是GAT－1超家族的成員；與Gly1和Gly2不同，ZmGly3沒有金屬結合位點；ZmGly3與馬蹄芒MlGly3同源性最高，親緣關系最近。

已有證據表明，Gly3參與了植物對逆境脅迫的應答。Ghosh等[17]對多種脅迫條件下的水稻DJ－1轉錄本研究發現，OsDJ－1(即OsGly3)受外源MG的強烈誘導，其中OsDJ－1C在不依賴于GSH的情況下將MG直接降解；OsDJ－1C在水稻的所有發育階段和組織中表現出較高水平的組成型表達。Manoj等[10]發現在干旱和鹽脅迫條件下抗性較強的野生近緣種甘蔗Gly3比商品種具有更高的表達水平。Meera等[19]研究發現鹽脅迫下紅樹RmGly1和RmGly2的相對表達量明顯高于RmGly3。Mohanan等[20]發現過表達EaGly3的甘蔗抗旱性增強。本研究結果表明，正常條件下，ZmGly3在玉米根、莖和葉中均有表達，但在莖中最高；在干旱和鹽脅迫條件下，ZmGly3在根和葉片中的表達量增加，但在莖中的表達受干旱和鹽脅迫影響不同，在干旱處理下降低而在鹽處理下增加。

可見，ZmGly3參與了玉米對干旱和鹽脅迫的應答，但在不同器官中對不同脅迫條件的響應并不完全一致。今后還需對其具體的生物學功能進行進一步解析。