PAK1 和PAK4 在不同毛色綿羊皮膚中的表達與定位

趙紅霞，王志鵬，王天元，賽務加甫，龐全海*

（1.山西農業大學動物醫學學院，山西太谷 030801；2.山西中國輻射研究院，山西太原 030000；3.山西省柳林縣動物疫病預防控制中心，山西柳林 033300；4.石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832003）

對哺乳動物的毛色長期研究發現，哺乳動物的毛色、眼睛顏色和膚色由體內黑色素的數量、質量和分布狀況決定[1]。PAK 家族包括PAK1和PAK4[2]。有實驗證實PAK4 是CREB 的一個關鍵調節因子[3]，它作用于小眼畸形相關轉錄因子（MITF）的上游，MITF 是黑素生成的主要轉錄因子[4]，激活的PAK4 通過2 條不同的信號通路促進黑素合成：CREB/MITF/酪氨酸酶和β-catenin/MITF 信號通路[5]。同時有研究表明PAK1和PAK4參與皮膚細胞黑素合成[6]。PAK1 調控的信號轉導通路包括MAPK、AKT、WNT1/β-catenin、ERα、BAD 和NF-κB 等增殖和生存通路[7]。PAK1 還參與了細胞運動的調節，傳遞控制細胞骨架動態、細胞形狀和粘附的各種信號通路[8]。PAK4 是一個信號整合子，調節許多基本的細胞過程[9]，包括肌動蛋白細胞骨架動力學、細胞形態和運動、細胞存活、胚胎發育、免疫防御和致癌轉化[10]。國內外已有對小鼠中PAK1和PAK4基因影響黑色素生成等方面調控的研究，但在綿羊中PAK1 和PAK4 的相關研究尚未發現。本實驗以白色、棕色和黑色綿羊為研究對象，通過qRT-PCR、Western Blotting、免疫組織化學等技術檢測不同毛色綿羊皮膚中PAK1 和PAK4 的表達與定位，為其他品種綿羊毛色的研究奠定基礎，增進對綿羊毛色生成調控機制的理解。

1 材料與方法

1.1 實驗取材 在山西農業大學羊場隨機選取健康性成熟的白色、棕色和黑色哈薩克綿羊各3 只，取背部皮膚組織各3 塊。其中2 塊放入液氮中用于提取總RNA 和蛋白，1 塊直接放入4%的甲醛固定液中固定，制作組織切片，用于免疫組織化學分析。

1.2 實驗試劑 Trizol Reagent（Invitrogen 公司）；Prime ScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）反轉錄試劑盒、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）試劑盒（TaKaRa 公司），PAK1 兔抗多克隆抗體（武漢三鷹生物技術公司）；PAK4 兔抗多克隆抗體（武漢三鷹生物技術公司）；Rabbit anti-β-actin 多克隆抗體、Goat Anti-Rabbit IgG（武漢三鷹生物技術公司）；組織蛋白提取試劑盒、凝膠制備試劑盒、DAB 試劑盒、BCA 蛋白濃度試劑盒、ECL Plus 超敏發光液（北京索萊寶生物技術公司）；免疫組化試劑盒（北京中杉金橋）。

1.3 實驗方法

1.3.1 總RNA 提取及cDNA 的合成 使用Trizol 試劑分離保存于液氮中的黑、棕、白色綿羊皮膚組織的總RNA，用PrimeScriptTM RT Master Mix（Perfect Real Time）反轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA，-20℃冰箱保存。

1.3.2 引物的設計與合成 在NCBI 上檢索綿羊的PAK1和PAK4序列并使用Premier 5.0 引物設計軟件設計熒光定量PCR 擴增引物，引物由寶生物工程（大連）有限公司設計并合成，引物序列見表1。

表1 引物序列及PCR 擴增條件

1.3.3 qRT-PCR 檢測 根據TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）擴增特異性DNA 序列，反應體系25 μL：TB GreenTMPremix Ex TaqTMII 12.5 μL，10 μmol/μL的 正、反向引物各0.8 μL，50 ng/μL 的cDNA模板2.0 μL，ROX Reference Dye II 0.4 μL 和ddH2O（滅菌蒸餾水）6.0 μL。反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，63℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40 個循環。結束后得到擴增曲線、熔解曲線和CT 值，用2-ΔΔCT法計算定量結果。

1.3.4 Western Boltting 檢測 將存于液氮中的樣品組織研磨后，根據組織蛋白提取試劑盒提取總蛋白，使用核酸蛋白測定儀測定其濃度。在10%SDS-PAGE 電泳分離后，200 mA 轉膜90 min，5%的脫脂奶粉封閉1 h，4℃過夜孵育一抗（1:1 000 稀釋PAK1 兔抗多克隆抗體；1:500 稀釋PAK4 兔抗多克隆抗體）。次日TBST 緩沖液洗膜，10 min×3，孵育二抗（1:5 000，HRP-山羊抗兔IgG），室溫搖床1 h，TBST 緩沖液10 min×3，最后用膠片暗室曝光。使用Image-Pro Plus8.0 軟件檢測目的蛋白和內參灰度值，用SPSS 軟件進行統計分析。

1.3.5 免疫組織化學檢測 將置于4% 甲醛固定液固定24 h 的樣品組織取出，經梯度酒精脫水后進行包埋并制作切片。將切片置于檸檬酸鈉修復液中進行抗原修復，然后滴加內源性過氧化物酶阻斷劑，室溫下孵育10 min，PBS 沖洗。滴加山羊血清工作液室溫孵育15 min，棄去血清，切片一側滴加1:100 稀釋的Rabbit Anti-PAK1 抗體（1:50 稀釋的Rabbit Anti-PAK4 抗體），陰性對照組滴加PBS，4℃過夜孵育。次日PBS 沖洗之后滴加生物素標記山羊抗兔IgG 聚合物，室溫孵育15 min，PBS 沖洗，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素，室溫孵育15 min，PBS 沖洗；滴加DAB 顯色液，使用顯微鏡鏡下控制顯色時間，將染色控制在最佳狀態，PBS 沖洗；蘇木素復染40 s，蒸餾水沖洗，75%的鹽酸酒精分化1 min。最后脫水，透明，中性樹膠封片。使用光學顯微鏡對實驗結果進行拍照。

1.4 數據分析 采用GraphPad Prism 8 軟件對數據作單因素方差分析，實驗結果表示為平均值± 標準偏差（SD）。P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結果

2.1PAK1、PAK4在不同毛色綿羊皮膚組織中mRNA的相對表達量 qRT-PCR 結果顯示（圖1A），PAK1mRNA 在黑色綿羊皮膚中的表達量分別是棕色和白色的3.05 倍和7.29 倍（P＜0.01），棕色綿羊皮膚中的表達量是白色的2.39 倍（P＜0.01）。圖1BPAK4mRNA在黑色綿羊皮膚中的表達量分別是棕色和白色的3.47倍和7.7 倍（P＜0.01），棕色綿羊皮膚中的表達量是白色的2.22 倍（P＜0.05）。

圖1 PAK1 和PAK4 mRNA 的相對表達量

2.2 PAK1、PAK4 蛋白在不同毛色綿羊皮膚組織中的相對表達量 Western Blotting 結果顯示（圖2A），在黑、棕和白色綿羊皮膚組織中均存在與PAK1、PAK4 多克隆抗體發生陽性反應的條帶，PAK1、PAK4 和GAPDH分別在分子量為64 kDa、65 kDa 和36 kDa 檢測到條帶。使用Image-Pro Plus 6.0 軟件對目的蛋白曝光出印跡的面積和灰度值計算出相關數據，將其同GAPDH 的條帶值相比較，經過統計分析的結果可知，PAK1 蛋白在黑色綿羊皮膚中的表達量是棕色綿羊皮膚的1.26倍，是白色綿羊皮膚的1.34 倍；PAK4 蛋白在棕色和黑色綿羊皮膚中的表達量分別是白色綿羊皮膚的1.81倍和2.2 倍，黑色綿羊皮膚的表達量是棕色綿羊皮膚的1.21 倍。

圖2 PAK1 和PAK4 蛋白在黑色、棕色和白色綿羊皮膚的蛋白相對表達量

2.3 不同毛色綿羊皮膚組織中PAK1 蛋白和PAK4 蛋白的表達與定位 通過免疫組織化學對PAK1 蛋白和PAK4 蛋白在綿羊皮膚組織中的表達進行定位研究，結果顯示（圖3），PAK1 蛋白在白色綿羊的表皮、根鞘、毛干中有陽性表達，在黑色綿羊的表皮、根鞘、毛球中有陽性表達，在棕色綿羊的表皮、根鞘中有陽性表達，而相應的陰性對照中無表達。PAK4 蛋白在白色、黑色和棕色綿羊的表皮、根鞘、毛基質中均有表達，而相應的陰性對照中無表達（圖4）。

圖3 PAK1 蛋白在綿羊皮膚中的定位

圖4 PAK4 蛋白在綿羊皮膚中的定位

3 討 論

毛囊是哺乳動物特有的皮膚附屬器官[11]，具有復雜的形態變化和生理發育過程[12]。毛囊數量龐大且位于體表，易于操作，是研究細胞增殖、分化、凋亡等科學問題的良好模型[13]。研究發現，含羞草四肽（MFFY、MFWY 和MFYY）和組氨酸衍生物（H1-3）有抗黑素活性。這些化合物的抗黑色素生成活性很可能主要是由于它們的抗PAK1 作用[6]。許多草本PAK1 阻斷劑，如蜂膠和姜黃素，已被證明通過下調酪氨酸酶以及黑素合成/致癌轉錄因子（如β-catenin 和MITF）來抑制黑素合成[14]，β-catenin 是PAK1 和PAK4 等激酶的直接底物之一，這些轉錄因子對酪氨酸酶基因的激活是必不可少的[15]。

PAK1 通過在Ser 675 磷酸化直接激活β-catenin[16]，導致MITF 的激活，這對于編碼黑素生成酶如酪氨酸酶（Tyr）基因的表達是必需的。PAK4 也通過激活2 種轉錄因子CREB 和β-catenin 參與同一黑色素瘤細胞系的黑色素生成[17]，這2 種轉錄因子對MIFT 激活都是必需的[18]。本實驗發現PAK1 mRNA 和蛋白在黑色綿羊皮膚中的表達量最高，棕色次之，白色最低。前人研究發現從人黑素細胞中分離出的富含黑素小體的組分表達PAK1 和N-WASP。PAK1 激酶活性的降低會影響黑素生成[19]。

PAK4 是生物學界最新發現的一類蛋白因子[20]，它在細胞信號轉導過程中起非常重要的作用[21]。PAK1 負責誘導性黑素生成，而PAK4 主要負責基礎黑素生成[17]。PAK4 是CREB 的關鍵調節因子[22]，在UV/α-MSH 誘導的黑素合成中，PAK4 上調了MITF 的轉錄[23]。PAK4 通過CREB 和Wnt/β-catenin 信號通路促進α-MSH/UVB誘導黑素合成，并提示PAK4 可能是治療色素沉著障礙的潛在靶點[5]。本實驗發現PAK4mRNA 和蛋白在黑色綿羊皮膚中的表達量最高，棕色次之，白色最低，與前人研究結果一致[5]。推測PAK4 可能通過誘導黑色素的生成進而調控哈薩克綿羊毛色生成過程。

哺乳動物的毛色主要取決于黑色素在皮膚和頭發中的類型、數量和分布[24]，在對小鼠的研究中發現黑色素是在毛囊球莖中產生的[25]。在老鼠皮膚的毛發部分，分化的黑素細胞被限制在毛囊的球狀區域，在那里它們負責毛發的色素沉積。本實驗也發現PAK1 蛋白在白色綿羊的表皮、根鞘、毛干中有陽性表達，在黑色綿羊的表皮、根鞘、毛球中有陽性表達，在棕色綿羊的表皮、根鞘中有陽性表達。PAK4 蛋白在白色、黑色和棕色綿羊的表皮、根鞘還有毛基質中也有表達，表明PAK1 和PAK4 對毛囊發育及毛色形成具有一定作用。

4 結 論

本實驗結果表明，PAK1和PAK4基因在棕色和黑色綿羊皮膚中的相對表達量顯著高于白色綿羊皮膚；PAK1 和PAK4 蛋白在棕色和黑色綿羊皮膚中的相對表達量顯著高于白色綿羊皮膚；PAK1 蛋白在白色綿羊的表皮、根鞘、毛干表達，在黑色綿羊的表皮、根鞘、毛球表達，在棕色綿羊的表皮、根鞘表達，PAK4 蛋白在白色、黑色和棕色綿羊的表皮、根鞘、毛基質中均有表達。綜上表明，PAK1 和PAK4 可能通過誘導黑色素的生成進而調控哈薩克綿羊毛色生成過程。