褪黑素抑制玉米赤霉烯酮誘導的豬卵巢顆粒細胞凋亡

周佳偉，吳俊靜，喬 木，王孝忠，劉貴生，梅書棋，彭先文

（1.湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所/動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，武漢 430064；2.湖北省宜昌市動物疫病預防控制中心，湖北 宜昌 443000）

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEA）是由鐮刀菌屬產生的一種真菌毒素，具有類雌激素作用，能夠與雌激素受體α 和雌激素受體β 結合，導致雌激素水平失調，影響動物生殖［1］。卵泡內包括卵母細胞、顆粒細胞和壁細胞，雌激素主要由顆粒細胞產生，雌激素/孕酮的比例直接影響卵泡的發育，當雌激素/孕酮比例過低會導致顆粒細胞的凋亡，引發卵泡閉鎖［2］。研究表明，ZEA 會促進卵巢顆粒細胞的凋亡、阻礙卵母細胞的成熟并提高細胞內的活性氧的水平［3-5］。

褪黑素（Melatonin，MT）主要是由哺乳動物下丘腦松果體產生的一種吲哚胺類激素，已被報道與卵泡發育過程密切相關［6］。Liu 等［7］進一步研究發現褪黑素不僅提高豬卵巢顆粒細胞中雌激素的含量，且可以調控與細胞增殖及凋亡等相關基因的表達水平。Wang 等［8］發現褪黑素通過褪黑素受體上調BCL2、BCL-XL、GPX4 和SOD1 的表達和下調BAX、CASP3 和TP53 的表達來抑制卵巢顆粒細胞的凋亡。在氧化應激條件下，褪黑素通過PI3K/AKT 信號通路抑制FOXO1 蛋白的轉錄活性以及介導SIRT信號通路提高FOXO1 蛋白的去乙?；?，從而提高小鼠卵巢顆粒細胞的抗氧化能力并抑制細胞自噬［9］。

本研究從3～5 mm 的卵泡中抽取卵泡液，分離豬卵巢顆粒細胞，通過添加不同濃度的ZEA 探究其對豬卵巢顆粒細胞凋亡的影響，并進一步通過加入不同濃度的褪黑素來檢測褪黑素能否抑制ZEA 對豬卵巢顆粒細胞凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞分離及培養

從武漢市某生豬屠宰場采集豬卵巢組織，用37 ℃含1% 雙抗（鏈霉素和青霉素）的PBS 溶液清洗3 次，用1 mL 注射器扎破直徑3～5 mm 的卵泡，抽取卵泡液，靜置2 min；將收集好的卵泡液依次使用100 μm 和70 μm 的細胞篩過濾，將過濾后的卵泡液1 000 r/min 離心5 min，棄上清；加入含1% 雙抗無血清DMEM/F12 培養基洗滌，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，重復3 次；加入含1% 雙抗和10%FBS 的DMEM/F12 細胞培養基，放置在37 ℃下5%CO2細胞培養箱中培養；分離24 h 后更換新鮮細胞培養基，48 h 后便可將豬卵巢顆粒細胞接種，用于后續試驗。

1.2 豬卵巢顆粒細胞凋亡檢測

分離豬卵巢顆粒細胞，接種到6 孔板中，當細胞密度達2×106個/mL 時，分別使用0、3、10、30、50 和100 μmol/L 的ZEA 處理細胞，24 h 后每孔加入400 μL 不含EDTA 的胰酶消化細胞，用含10% FBS 的DMEM/F12 培養基終止消化并收集細胞；用PBS 溶液洗滌細胞2 次，2 000 r/min 離心5 min，收集細胞；加入500 μL 的Binding Buffer 懸浮細胞；加入5 μL Annexin V-FITC 混勻后，再加入5 μL Propidium Iodidie，混勻；室溫、避光、靜置15 min；上機檢測。

1.3 豬卵巢顆粒細胞的活力檢測

分離豬卵巢顆粒細胞，將其接種到96 孔板中，當細胞密度達2×106個/mL 時，分別使用0、0.1、1、10 和100 μmol/L MT 的無血清培養基培養細胞，24 h 換液，PBS 溶液洗滌2 次后更換30 μmol/L 的ZEA 處理豬卵巢顆粒細胞，ZEA 處理后24 h，每孔加入10 μL CCK8 試劑，并將細胞繼續放置到培養箱中培養4 h；使用酶標儀檢測樣品在450 nm 波長下的吸光度。

2 結果與分析

2.1 ZEA 顯著促進豬卵巢顆粒細胞的凋亡

采集母豬卵巢，從3～5 mm 的卵泡中抽取卵泡液，分離豬卵巢顆粒細胞，當細胞密度達2×106個/mL時，分別使用0、3、10、30、50 和100 μmol/L 的ZEA處理細胞，24 h 后收集細胞，通過流式細胞術檢測凋亡細胞的比例（圖1）。3 和10 μmol/L 的ZEA 對豬卵巢顆粒細胞凋亡的影響不顯著，而30、50 和100 μmol/L 均顯著促進豬卵巢顆粒細胞的凋亡，且隨著ZEA 濃度的增加，凋亡細胞比例逐漸提高。ZEA 可顯著促進豬卵巢顆粒細胞的凋亡，且呈現劑量效應關系。

圖1 ZEA 促進豬卵巢顆粒細胞的凋亡

2.2 褪黑素抑制ZEA 誘導的豬卵巢顆粒細胞凋亡

細胞內活性氧的積累是ZEA 導致細胞凋亡的關鍵因素，而MT 作為一種廣譜抗氧化劑，能夠有效減少由氧化應激引發的細胞凋亡。本研究中檢測MT 能否抑制ZEA 引發的豬卵巢顆粒細胞的凋亡，將MT 加入到DMEM/F12 培養基中，稀釋成含有0、0.01、0.1、1、10 和100 μmol/L MT 的無血清培養基，分別用其處理豬卵巢顆粒細胞，24 h 后更換30 μmol/L 的ZEA 處理豬卵巢顆粒細胞，ZEA 處理后24 h。如圖2 所示，0.1 和1 μmol/L 的MT 均能夠顯著抑制ZEA 引起的豬卵巢顆粒細胞的凋亡，且0.1和1 μmol/L 的MT 均能顯著提高細胞的活力。適宜濃度的MT 可以作為一種保護劑抑制ZEA 引起的豬卵巢顆粒細胞的凋亡。

3 討論

ZEA 是豬場飼料的主要污染物之一，母豬過量食入會攻擊生殖系統，其以卵巢顆粒細胞為主要靶點，影響卵泡發育，降低母豬產仔數。Zhang 等［10］通過轉錄組測序發現ZEA 可通過調節lncRNA 的表達來調節細胞周期相關基因CDK1、CCNB1、CDC25A 和CDC25C 的表達，導致豬卵巢顆粒細胞周期阻滯在G2/M 期。并且ZEA 也可通過調節與細胞凋亡相關miR-744、miR-1343 和miR-331-3p的表達，從而促進細胞凋亡［11］。本研究通過使用不同濃度ZEA 處理豬卵巢顆粒細胞，發現30、50 和100 μmol/L 的ZEA 顯著促進豬卵巢顆粒細胞的凋亡，且呈現劑量效應關系。

圖2 MT 抑制ZEA 誘導的細胞凋亡

目前，針對ZEA 誘導豬卵巢顆粒細胞凋亡的保護性化合物的研究較少。Lai 等［12］研究發現在卵泡生長液或卵母細胞成熟液中添加溶血磷脂酰膽堿可部分保護ZEA 對卵泡腔形成和卵母細胞成熟的影響。另有研究檢測了20 種中藥提取物對ZEA 所誘導的小鼠卵巢顆粒細胞凋亡的保護作用，表明綠原酸可顯著抑制ZEA 誘導的小鼠卵巢顆粒細胞的凋亡［13］。由于ZEA 可導致細胞內ROS 的積累，而MT是一種廣譜的細胞抗氧化劑，因此，本研究檢測MT是否保護ZEA 誘導的豬卵巢顆粒細胞的凋亡，結果發現0.1 和1 μmol/L 的MT 抑制30 μmol/L 的ZEA對豬卵巢顆粒細胞凋亡的影響，提高細胞的活力。

本研究發現，ZEA 促進豬卵巢顆粒細胞的凋亡，且呈現劑量效應關系，而MT 可抑制ZEA 誘導的豬卵巢顆粒細胞的凋亡，在養豬生產中MT 可用來預防ZEA 引起的母豬繁殖性能降低。