3 種鋅源對斷奶仔豬生長性能、腹瀉率、腸黏膜形態及腸道菌群多樣性的影響

郭 彤，周金柱，李二偉，黃世猛，李運川，劉秀娟，孟靈彪，顧 俊，呂家煌，李 彬

（1.北京農業職業學院畜牧獸醫系，北京 102442；2.江蘇省農業科學院獸醫研究所，江蘇南京 210014；3.北京桃古圖新材料有限公司，北京 100025）

預防和降低斷奶仔豬應激產生的腹瀉是養殖生產研究的熱點[1-2]。研究表明，飼糧中添加高劑量氧化鋅能有效降低仔豬早期斷奶帶來的應激[3]。但長期添加高劑量氧化鋅會導致資源浪費、環境污染，甚至對人類健康產生嚴重危害[4]。因此，降低日糧中鋅的添加量、尋找安全環保的鋅替代品成為亟待解決的問題。

納米氧化鋅具有顆粒小、比表面積大、吸附率高等特點，可提高鋅的生物利用率，降低氧化鋅的使用量，在豬、雞上已有研究報道[5-6]。由于納米氧化鋅能滲入到細胞和組織內，使細胞壞死和組織發生病變[7]，其對動物可能有毒害作用[8-9]。蒙脫石能吸附腸道致病菌、病毒及其產生的毒素并將其固定，隨糞便排出體外[10]，在治療畜禽腹瀉性疾病、保護腸黏膜方面具有良好的療效[11-13]，且綠色環保、無耐藥性、無毒副作用，已被廣泛應用于畜禽養殖生產中[14]。蒙脫石本身無抑菌或殺菌作用，但載入金屬離子（Ag+、Cu2+、Zn2+）或金屬氧化物（TiO2、ZnO）后，具有了強大的殺菌作用[15]，能將動物腸道有害菌殺滅，起到類似抗生素的作用。

本試驗將納米氧化鋅負載在蒙脫石上制備出新型改性蒙脫石——蒙脫石負載型氧化鋅，旨在研究普通氧化鋅、納米氧化鋅和蒙脫石負載型氧化鋅對斷奶仔豬生長性能、腹瀉率、腸黏膜形態及腸道菌群多樣性的影響，為蒙脫石負載型氧化鋅在斷奶仔豬生產中的應用提供科學依據，為高鋅飼糧替代品的研發提供理論和實踐指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 普通氧化鋅（飼料級，鋅含量≥76.3%）由石家莊百勝化工有限公司提供；納米氧化鋅（飼料級，鋅含量≥77%）由濟源魯泰納米材料有限公司提供；蒙脫石負載型氧化鋅（飼料級，鋅含量≥30%）由北京桃古圖新材料有限公司提供。

1.2 試驗設計與試驗日糧 選擇144 頭體重（7.0±0.2）kg的杜× 長× 大三元雜交仔豬，按胎次一致、體重相近原則，采用隨機區組設計分為4 組，每組6 個重復，每個重復6 頭（公母各半）。對照組飼喂基礎日糧，試驗組分別在基礎日糧中添加3 000 mg/kg 普通氧化鋅、1 500 mg/kg 納米氧化鋅、600 mg/kg 蒙脫石負載型氧化鋅（均以鋅計）。預試期7 d，試驗期14 d?；A日糧參照NRC（2012）斷奶仔豬營養需要配制成粉狀全價料，基礎日糧組成及營養成分見表1。

表1 基礎日糧組成和營養成分（風干基礎）

1.3 飼養管理 飼養試驗于2021 年4 月—2021 年5 月在如皋博益牧業有限公司進行。豬場具有規?；a設備，防疫和飼養管理科學規范，完全滿足試驗要求。仔豬在保育床上飼養，自由采食和飲水，按時清理衛生，從7 日齡開始誘食并哺乳至21 日齡斷奶，按常規程序對仔豬進行免疫和定期消毒。

1.4 樣品采集與保存 飼養試驗結束稱重后，從各組中隨機選取體重接近平均體重的試驗豬各12 頭（每個重復2 頭，公母各半），繼續飼喂0.5 h，仔豬采食2 h 后屠宰。各組斷奶仔豬屠宰后無菌操作取出回腸和結腸內容物各約2 g，消毒結扎后其中1 g 放入消毒容器中，4℃立即運回無菌操作室，無菌超凈臺內將腸道內容物充分與生理鹽水混合，對其所含微生物（如大腸桿菌、沙門氏菌）數量進行檢測。另外1 g 放入5 mL 凍存管并迅速置于液氮中，用于腸道菌群多樣性分析。

屠宰后，分別在各斷奶仔豬十二指腸、空腸、回腸相同部位取長度約1～2 cm 的腸道組織，切開小腸于相同位置分別取0.5 cm×0.5 cm 的組織，用生理鹽水清洗干凈后，置于10%甲醛溶液中固定，4℃保存，用于光鏡分析其形態結構的變化。

1.5 測定指標及方法

1.5.1 生長性能及腹瀉率 試驗期間每天精確記錄采食量和腹瀉狀況。試驗結束后，禁食12 h（自由飲水）后稱重，按每個重復計算平均日采食量（ADFI）、平均日增重（ADG）、耗料增重比（F/G）。每天定時記錄仔豬腹瀉情況，于試驗結束后計算每個處理組的腹瀉率。計算公式：

腹瀉率=（腹瀉頭數× 腹瀉天數）/（試驗頭數×試驗天數）×100%

1.5.2 腸道內鋅含量 稱取0.2 g 左右腸道內容物，將樣品分別加入洗凈的聚四氟乙烯消解管中，并用移液槍加入5 mL 65% HNO3和2 mL HF。之后密閉并按微波消解儀（CEM-MARS6，美國）的相應要求及消解程序進行消解。消解后，待消解液冷卻到60℃以下，取出消解罐，將消解液置于50 mL 容量瓶中，用少量超純水清洗消解管3 次，清洗液倒入容量瓶中，用超純水定容、搖勻，取適量用電感耦合等離子體質譜儀（ICP-MS，賽默飛世爾科技有限公司）檢測鋅含量。

1.5.3 腸黏膜形態 用Leica 組織切片機將腸段樣品經固定、修整、沖洗、脫水、切片（厚度約5 μm）和蘇木精-伊紅（HE）染色制成切片，每個樣品制作3 個非連續性的縱切片和橫切片。用 Leica Qwin 圖像分析儀對絨毛高度、隱窩深度進行顯微測量和分析，每張縱切片測定10 個絨毛高度和隱窩深度，取其平均值作為1 個測定數據，并計算絨毛高度/隱窩深度。

1.5.4 腸道菌群 在無菌工作臺中將取出的回腸和結腸內容物各取0.5 g 放入無菌試管中，并加入4.5 mL 無菌稀釋液，在磁力震蕩器上震蕩3～5 min，記此液為10-1稀釋液；隨后吸取0.5 mL 稀釋液（10-1）加入到含有4.5 mL無菌稀釋液的無菌試管中，震蕩后記為10-2稀釋液，再依次進行10-3到10-6倍稀釋。分別將不同腸段、不同稀釋度的稀釋液涂布在各培養基上，采用平板計數法進行菌落計數，用每克腸道內容物中細菌個數的對數（Log10CFU/g）表示。每個稀釋度均設3 個重復。檢測致病菌大腸桿菌、沙門氏菌的數量。根據菌群和細胞形態、革蘭氏染色、耗氧性來鑒定細菌種類。

1.5.5 腸道菌群多樣性 將樣品送至上海派森諾生物技術公司，使用高通量測序技術對回腸和結腸內容物進行16S rRNA 基因測序。

1.6 統計分析 所有的數據采用SPSS 22.0 進行方差分析，采用Duncan's 多重檢驗分析組間差異，以P＜0.05 作為差異顯著性判斷標準，結果均以平均值±標準差表示。

2 結果

2.1 不同鋅源對斷奶仔豬生長性能和腹瀉率的影響 由表2 可知，普通氧化鋅組、納米氧化鋅組和蒙脫石負載型氧化鋅組斷奶仔豬平均日增重較對照組分別提高了19.2%、38.5% 和65.9%（P＜0.05）；耗料增重比較對照組分別降低了17.1%、26.7% 和32.7%（P＜0.05）；腹瀉率分別降低了54.4%、62.5%和87.4%（P＜0.05）。

表2 不同鋅源對斷奶仔豬生長性能和腹瀉率的影響（n=6）

2.2 不同鋅源對斷奶仔豬回腸食糜中鋅含量的影響 由圖1 可見，普通氧化鋅組、納米氧化鋅組和蒙脫石負載型氧化鋅組仔豬回腸食糜中鋅含量較對照組分別提高了16.87%、72.37%和83.97%（P＜0.05）。蒙脫石負載型氧化鋅組仔豬回腸食糜中鋅含量最高，高達2 713 mg/kg，高于納米氧化鋅組和普通氧化鋅組（P＜0.05）。

圖1 不同鋅源對斷奶仔豬回腸食糜鋅含量的影響（n=6）

2.3 不同鋅源對斷奶仔豬腸道常見致病菌數量的影響由表3 可見，與對照組相比，蒙脫石負載型氧化鋅組斷奶仔豬回腸和結腸中大腸桿菌和沙門氏菌的數量分別降低了100%、100% 和77.8%、100%（P＜0.05）；與納米氧化鋅組和普通氧化鋅組相比，蒙脫石負載型氧化鋅組回腸中大腸桿菌和沙門氏菌的數量均降低了100%（P＜0.05），結腸中大腸桿菌和沙門氏菌的數量分別降低了52.7%、68.8%和100%、100%（P＜0.05）。

表3 不同鋅源對斷奶仔豬腸道中常見致病菌數量的影響（n=6） log10 CFU/g

2.4 不同鋅源對斷奶仔豬腸黏膜形態的影響 由表4 可知，與對照組相比，蒙脫石負載型氧化鋅組十二指腸、空腸和回腸的絨毛高度分別提高了36.8%、43.5% 和61.9%（P＜0.05）；十二指腸、空腸和回腸絨毛高度/隱窩深度分別提高了92.5%、90.0%和91.4%（P＜0.05），且優于普通氧化鋅組和納米氧化鋅組（P＜0.05）。

表4 不同鋅源對斷奶仔豬腸道絨毛高度和隱窩深度的影響（n=6）

2.5 不同鋅源對斷奶仔豬腸道菌群多樣性的影響 由圖2A 可知，在門水平上，仔豬回腸內容物菌群主要由厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、藍藻菌門（Cyanobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）等組成，各組均以厚壁菌門豐度最高，普通氧化鋅組和納米氧化鋅組放線菌門豐度也較高。由圖2B 可知，仔豬結腸內容物菌群主要由厚壁菌門、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門和變形菌門等組成，各組中厚壁菌門豐度最高?？梢?，不同鋅源對仔豬腸道內容物在門水平上的組成差異不顯著，優勢菌群均是厚壁菌門，占比超過90%。

由圖2C 可知，在屬水平上，對照組仔豬回腸以梭菌屬（Clostridium_sensu_stricto_1）為主要優勢菌群，而在試驗組仔豬回腸的優勢菌群是乳桿菌屬（Lactobacillus）和鏈球菌屬（Streptococcus）。其中，蒙脫石負載型氧化鋅組中優勢菌群為乳桿菌屬，占菌群總豐度80% 以上，遠高于對照組、普通氧化鋅組和納米氧化鋅組。4 個組仔豬的結腸微生物菌群差異不顯著，主要優勢菌群為乳桿菌屬（Lactobacillus）（圖2D）。

圖2 不同鋅源對斷奶仔豬腸道菌群的影響（n=6）

3 討 論

3.1 不同鋅源對斷奶仔豬生長性能和腹瀉率的影響 斷奶仔豬早期因腸道發育尚未成熟，對由母乳轉變為固體飼料的消化吸收能力差，易導致腹瀉，生產性能降低。氧化鋅是防止腹瀉常用的飼料添加劑。大量研究表明，高劑量氧化鋅能促進仔豬生長，減少腹瀉率，但由于其生物利用率低，會造成鋅源浪費和對環境產生污染而被禁用[16]。納米氧化鋅具有粒徑小、比表面積高和高化學活性等特點，可提高對腸黏膜的吸附性和停留時間，從而提高鋅的生物利用率[17]。但近年來發現，納米氧化鋅對動物可能存在一定的毒性作用[18]。本試驗結果表明，斷奶仔豬日糧中添加1 500 mg/kg 納米氧化鋅提高仔豬平均日增重和降低腹瀉率的效果優于3 000 mg/kg普通氧化鋅，并未發現仔豬表觀上出現異常；日糧中添加600 mg/kg 蒙脫石負載型氧化鋅在提高仔豬平均日增重和降低腹瀉率方面顯著優于3 000 mg/kg 普通氧化鋅和1 500 mg/kg 納米氧化鋅。王彬等[19]研究也表明，飼糧中添加納米氧化鋅可顯著提高斷奶仔豬平均日采食量和平均日增重，降低耗料增重比和腹瀉率。劉漢鎖等[3]研究表明，與普通氧化鋅相比，飼糧中添加1 600 mg/kg納米氧化鋅可顯著降低斷奶仔豬腹瀉率。究其原因可能是由于蒙脫石具有強大的吸附和緩釋、控釋特性，氧化鋅具有強大的殺菌作用，蒙脫石負載納米氧化鋅后增強了納米氧化鋅與細菌的親和力，使其通過抑制細菌電子傳遞鏈中酶活性的方式達到抗菌目的[20]。同時，蒙脫石負載的納米氧化鋅微?？稍谧胸i腸道緩慢釋放，增加微粒與腸壁的接觸面積，延長接觸時間，使納米氧化鋅的生物利用率大大提高，因而促進了仔豬生長并降低了腹瀉率[14]。本研究結果提示，日糧中添加600 mg/kg蒙脫石負載納米氧化鋅既能降低鋅的添加量、減輕高鋅給環境帶來的壓力，又能促進仔豬生長、降低腹瀉率，且無毒無害，是高鋅日糧理想的替代品。

3.2 不同鋅源對斷奶仔豬回腸食糜中鋅含量的影響 腸道是動物生長的重要保障，是防止病原菌入侵的第一道防線。腸道的健康主要與其免疫功能有關。鋅對動物機體生長發育、免疫功能和腸道健康等方面均具有重要的調節作用[21]。腸道食糜鋅含量與其生物利用率關系密切。Davin 等[22]研究表明，在斷奶仔豬日糧中添加高劑量氧化鋅，回腸、結腸食糜中鋅含量顯著增加。劉漢鎖等[3]研究表明，納米氧化鋅組斷奶仔豬盲腸和結腸

食糜中鋅含量與對照組無顯著差異。而本試驗結果表明，納米氧化鋅在回腸食糜中的鋅含量顯著高于對照組?？赡苁羌{米氧化鋅微粒粒徑小，增加了與斷奶仔豬腸壁的接觸時間和面積，延長了與腸道黏膜的作用時間[25]，使其在回腸食糜中鋅含量顯著高于對照組。本試驗結果表明，蒙脫石負載納米氧化鋅組斷奶仔豬回腸食糜中鋅含量顯著高于普通氧化鋅組和納米氧化鋅組，可能與蒙脫石作為載體有關。首先，斷奶仔豬采食蒙脫石負載納米氧化鋅的飼糧進入胃之后減少了胃酸對氧化鋅的破壞，提高了其耐酸性，使其到達腸道的有效成分多于普通氧化鋅和納米氧化鋅[23]。其次，蒙脫石硅氧四面體片中的硅離子和鋁氧八面體片中的鋁離子在晶體形成中常被低價的陽離子同晶替代，使晶體帶有大量負電荷，為平衡負電荷使晶體保持中性，層間會吸附可交換的陽離子，使得蒙脫石具有強大的靜電吸附能力。通過靜電結合，蒙脫石吸附于消化道黏膜并與消化道黏液蛋白結合，提高了消化道黏液的分泌量，并增加其在腸道中的停留時間[14]；同時蒙脫石具有一定緩釋作用，可使層間納米氧化鋅緩慢釋放，兩者協同作用，最終提高了其在腸道中的濃度[24]。

3.3 不同鋅源對斷奶仔豬腸道常見致病菌數量的影響病原微生物的感染和繼發性感染會加劇斷奶仔豬腹瀉的發病率和致死率。研究表明，高劑量氧化鋅可降低小腸的細菌移位[26]，提高腸道菌群的穩定性和均勻性。Hu等[27]研究表明，斷奶仔豬飼糧中添加2 000 mg/kg 氧化鋅降低了回腸中梭狀芽孢桿菌的數量，但對大腸桿菌無影響，而添加500 mg/kg 載鋅蒙脫石可降低斷奶仔豬腸道梭狀芽孢桿菌和大腸桿菌的數量。本試驗結果表明，添加蒙脫石負載納米氧化鋅可殺滅回腸和結腸中的大腸桿菌和沙門氏菌，其殺菌效果明顯優于普通氧化鋅和納米氧化鋅，其原因主要是由于蒙脫石本身有強大的吸附細菌的能力，氧化鋅有殺菌作用，氧化鋅載入蒙脫石后，使蒙脫石失去了電子平衡后帶有過剩的正電荷，而大腸桿菌和沙門氏菌在生理pH 條件下呈負電荷[26]。通過靜電吸引，細菌被吸附到蒙脫石負載納米氧化鋅上，使富集在蒙脫石表面的氧化鋅直接殺滅細菌[24]。這也是蒙脫石負載納米氧化鋅能顯著降低早期斷奶仔豬腹瀉率的原因之一。

3.4 不同鋅源對斷奶仔豬腸黏膜形態的影響 鋅作為腸道上皮細胞發育成熟的必需微量元素，有利于改善腸道形態，增加蛋白質合成和腸道細胞增殖[28]。機體對營養物質的吸收主要在小腸，吸收能力的高低與小腸的絨毛高度、隱窩深度以及兩者的比值有關。小腸絨毛越高，腸道上皮細胞越多，腸道的吸收能力越強。隱窩深度可反映腸上皮細胞的形成速率。隱窩深度越淺，表明成熟細胞向上移動速率越高。而絨毛高度/隱窩深度值則可綜合反映腸道的功能狀況。Wang 等[5]研究表明，添加納米氧化鋅可改善斷奶仔豬腸道形態，增加十二指腸和回腸絨毛長度和絨毛表面積，降低隱窩深度。Hu 等[27]研究表明，斷奶仔豬飼糧中添加500 mg/kg 載鋅蒙脫石和2 000 mg/kg 氧化鋅使空腸黏膜絨毛高度和絨毛高度/ 隱窩深度值顯著增加。本試驗結果也表明，3 種鋅源飼料對腸黏膜形態均有改善作用，且蒙脫石負載納米氧化鋅組斷奶仔豬十二指腸、空腸、回腸的絨毛高度、絨毛高度/隱窩深度值顯著優于普通氧化鋅組和納米氧化鋅組。分析其原因，一方面是由于蒙脫石本身可在消化道內形成一層保護膜，對各種病毒、細菌及所產生的毒素等有良好的吸附能力，阻止病原菌對腸上皮細胞的侵入，從而保護腸黏膜[24]；另一方面，蒙脫石負載納米氧化鋅能顯著降低腸道內大腸桿菌和沙門氏菌的數量，且氧化鋅可以在腸道內持續緩釋，從而保護了腸黏膜形態結構的完整性。此外，蒙脫石能夠與腸道黏液蛋白靜電結合，增加黏膜厚度，促進腸上皮細胞增殖和黏液分泌，增加黏液量，改善黏液質量[14]，從而對消化道黏膜起保護和修復作用，促進腸道發育。

3.5 不同鋅源對斷奶仔豬腸道微生物多樣性的影響 在正常情況下，仔豬腸道內的有害菌群和有益菌群相互制約、相互依賴，以維持腸道菌群動態平衡。仔豬斷奶產生應激會造成腸道菌群失調[29]，導致仔豬腹瀉、飼料轉化率下降。焦樂飛[15]研究表明，在門水平上，添加2 g/kg 載銅/鋅蒙脫石顯著提高了斷奶仔豬結腸厚壁菌門相對豐度，降低了擬桿菌門和變形菌門相對豐度；在屬水平上，顯著提高了乳桿菌屬、雙歧桿菌屬和優桿菌屬等有益菌屬相對豐度，顯著降低了梭菌屬和鏈球菌屬等有害菌屬相對豐度。本試驗結果表明，在門水平上，3 種鋅源組回腸和結腸中均以厚壁菌門相對豐度較高；在屬水平上，3 種鋅源組優勢細菌種屬為乳桿菌屬、雙歧桿菌屬，大大降低了回腸和結腸中梭菌屬和鏈球菌屬的相對豐度。飼糧中添加蒙脫石負載納米氧化鋅能夠有效降低仔豬回腸和結腸中梭菌屬和鏈球菌屬等致病菌的豐度，顯著提高優勢菌群——乳桿菌屬的豐度，分析其原因可能與形成蒙脫石-有益菌生物膜有關。雙歧桿菌和乳酸桿菌可通過代謝產生乳酸，乳酸在蒙脫石和益生菌之間形成酸性微環境，使細菌表面上帶負電的磷酸被蒙脫石表面的陽離子吸引，促進細菌聚集而形成蒙脫石-有益菌生物膜[15]，減少益生菌受腸道內消化酶、膽鹽等破壞，進而利于有益菌繁殖。綜上，蒙脫石負載納米氧化鋅在一定程度上具有優化和平衡腸道菌群結構、增強腸道菌群穩定性、保護腸黏膜形態完整性、降低仔豬腹瀉、促進仔豬生長的作用。

4 結 論

本研究結果表明，斷奶仔豬日糧中添加600 mg/kg蒙脫石負載型氧化鋅能提高仔豬生長性能，降低腹瀉率，改善腸黏膜形態和腸道菌群組成，其效果優于添加3 000 mg/kg 普通氧化鋅和1 500 mg/kg 納米氧化鋅，是高鋅日糧中鋅源理想的替代品。