高效液相色譜法分離飲料中的糖精鈉

司曉喜，董岳峰，楊 怡，張雪花，趙 楊，劉志華，李振杰，許志剛*

(1.云南煙草化學重點實驗室，云南中煙工業有限責任公司技術中心，云南 昆明 650231；2. 昆明理工大學 理學院，云南 昆明 650500)

0 引言

糖精鈉是一種常用于食品工業的人造甜味劑，具有悠久的使用歷史，但它也是最具爭議的合成甜味劑之一。它可使人食欲減退、低齡人群長期食用導致營養不良、短期大量使用還可能引發中毒等[1-2]。在我國食品添加劑使用標準中(GB 2760-2014)，對食品中糖精鈉的使用量進行了限制，食品中糖精鈉的添加量的范圍在0.15～5.0 g/kg之間[3]。未按照國家標準使用，或濫用，亦或者食品制造商隱瞞消費者擅自以糖精鈉作為替代品添加到食物中，都有極大可能對人體健康造成損害，尤其是正處于生長發育期的青少年。

食品安全國家標準GB 5009.28-2016[4]中詳細介紹了包括糖精鈉在內的3種食品添加劑的測定方法，有液相色譜法和氣相色譜法。另外，還有文獻報道了其他類型的檢測方法，如薄層色譜法[5]、離子選擇電極測定法[6]、滴定法[7]、HPLC-MS聯用[8]、分光光度法[9]等方法。其中最普遍、使用最廣泛的方法是高效液相色譜法，該方法具有簡單快速準確等優點[10-13]。本文采用高效液相色譜法對糖精鈉進行測定，并對色譜分離條件進行了優化，所建立的分析方法能有效測定飲料中糖精鈉的含量。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀(美國戴安公司)，配備DAD檢測器、自動進樣器；YMC-Pack CN色譜柱(250 mm×4.6 mmI.D.，S-5 μm，12 μm，YMC公司)；Innoval Neo XD C18色譜柱(250 mm×4.6 mmI.D.，5 μm，天津博納艾杰爾公司)；HILIC色譜柱(150 mm×4.6 mmI.D.，5 μm，天津博納艾杰爾公司)；PS-10A超聲波清洗機(深圳市潔康洗凈電器有限公司)。

乙酸銨(98%，西隴化工股份有限公司)；乙腈(色譜純，薩恩化學技術有限公司)；糖精鈉(98%，阿拉丁試劑上海公司)；實驗用水均為娃哈哈純凈水；飲料樣品購于昆明當地超市。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理方法

準確移取實際樣品100 μL于比色管中(汽水樣品需經過超聲脫氣)，用純水稀釋定容至10 mL，超聲混合均勻10 min后，用5 mL注射器吸取一定量溶液，經0.22 μm水系濾膜過濾后裝入液相小瓶，通過高效液相色譜儀進樣測定。每組樣品平行測定3份。

1.2.2 標準溶液的配制

準確稱取0.05 g的糖精鈉標準品，置于50 mL比色管中，以純水為溶劑，配置成濃度為1 000 mg/L的母液。采用逐級稀釋法配制成濃度為0.01 mg/L，0.05 mg/L，0.1 mg/L，0.5 mg/L，1.0 mg/L，2.0 mg/L，5.0 mg/L，10 mg/L和20 mg/L的標準溶液，通過高效液相色譜儀進行定量分析。

1.2.3 色譜分析方法

采用Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀檢測糖精鈉，流動相為乙腈-0.02 mol/L乙酸銨溶液，檢測波長為230 nm，進樣量為20 μL，對色譜柱的類型、流動相的配比，流速和柱溫等色譜條件進行優化。在最佳色譜條件下測定實際樣品中糖精鈉的含量，并進一步進行加標回收試驗，加標濃度分別為0.5 mg/L、5.0 mg/L、15 mg/L，計算其加標回收率和相對標準偏差。

2 實驗結果與討論

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 色譜柱的選擇

C18柱、HILIC柱和CN柱均對糖精鈉有一定的分離能力，分別采用3種類型的色譜柱對糖精鈉進行分離測定。結果如圖1所示，糖精鈉在C18柱上的色譜峰型出現嚴重拖尾現象，而在HILIC柱和CN柱上可以得到較好的色譜峰型，但糖精鈉在HILIC柱上出峰時間過早，與溶劑峰非常接近。而在CN柱上可以得到一個較合適的保留時間和較好的色譜峰型。因此，采用CN柱進行色譜分析。

圖1 不同色譜柱對糖精鈉的分離效果的色譜圖

2.1.2 流動相配比的優化

糖精鈉極性較強，在CN柱上保留效果較強，且保留時間合適。當流動相中乙腈和0.02 mol/L乙酸銨溶液的比例由20∶80(V∶V)向5∶95(V∶V)逐漸變化時，結果如圖2所示，出峰時間不斷增大，整體峰展寬也逐漸增大，但目標峰峰面積變化不大。在流動相比例為15∶85(V∶V)時，色譜峰型最好，出峰時間適中，目標峰與溶劑雜峰有較好的分離。因此，選擇流動相中乙腈-0.02 mol/L乙酸銨溶液的比例為15∶85(V∶V)。

圖2 流動相配比對糖精鈉分離影響的色譜圖

2.1.3 流速的優化

在CN色譜柱下，以比例為15∶85(V∶V)的乙腈-0.02 mol/L乙酸銨溶液為最佳流動相，探究流速對糖精鈉分離的影響。結果如表1和圖3所示，當流速由0.4 mL/min向0.9 mL/min變化時，出峰時間不斷提前，峰面積不斷減小，峰展寬也不斷減小，但柱壓隨流速的增大而逐漸增大。在流速為0.6 mL/min時，峰面積較大，出峰時間適中，峰展寬較小，且柱壓適中。因此，選擇0.6 mL/min為最佳流速。

表1 流速對糖精鈉分離的影響

圖3 流速對糖精鈉分離影響的色譜圖

2.1.4 柱溫的優化

在以上最優條件下，進一步進行柱溫的優化?？紤]到CN柱的使用環境，以20 ℃為最低溫度，柱溫由20 ℃向35 ℃變化。結果如圖4所示，在不同溫度下出峰時間變化不大，峰面積變化也不大，但峰展寬隨溫度升高先減小后增大，柱壓隨柱溫的升高而逐漸減小。當柱溫為25 ℃時，色譜峰型較好，峰展寬較小。因此，選擇25 ℃為最佳色譜柱溫。

圖4 柱溫對糖精鈉分離影響的色譜圖

2.2 線性方程、檢出限、定量限

采用逐級稀釋法配制了一系列濃度梯度的標準溶液。通過高效液相色譜儀進行定量分析。以糖精鈉的濃度(mg/L)為橫坐標，峰面積(mAU)為縱坐標繪制出標準曲線。標準曲線的線性方程為Y=0.80X+0.33，r=0.999 79，糖精鈉在0.01～20 mg/L范圍內線性關系良好。檢出限(S/N=3)為0.003 3 mg/L，定量限(S/N=10)為0.010 mg/L。

2.3 實際樣品分析及加標回收實驗

對從市面上隨機購買的4種飲料進行分析檢測，先按照1.2.1的實際樣品前處理方法進行樣品處理，再通過高效液相色譜進樣檢測，結果如表2所示，在4種飲料中均檢出了糖精鈉，檢出濃度在1.68～20.25 mg/L之間。

表2 實際樣品中糖精鈉的含量及加標回收率(n=3)

為了進一步驗證方法的適用性，在上述樣品分析的基礎上進行加標回收實驗。在飲料樣品中添加一定量的糖精鈉標準溶液，樣品的加標濃度分別為0.5 mg/L、5 mg/L、15 mg/L，平行測定3組。實際樣品分析色譜圖如圖5所示，目標峰與雜質干擾峰有較好的分離，且分析時間短、效率高?？鄢镜字岛蟮募訕嘶厥章试?0.37%～124.10%之間，相對標準偏差(RSD)在0.19%～9.39%之間。

圖5 實際樣品色譜圖

3 結論

糖精鈉是一種人造甜味劑，對人體無營養價值。當食用較多時，會影響腸胃消化酶的正常分泌，降低小腸的吸收能力，使人食欲減退。許多國家都限制了糖精鈉在食品加工中的使用量。但在生產經營活動中，少數企業為了片面追求產品的甜度、色澤或延長產品保質期，擅自違法過量使用糖精鈉等食品添加劑，對人體健康構成了潛在的威脅。本文采用高效液相色譜法測定不同飲料中的糖精鈉，測得飲料中糖精鈉的濃度在1.68～20.25 mg/L之間，所測飲料中糖精鈉的含量均符合國家食品添加劑使用標準。