肝癌細胞上皮-間質轉化的機制研究進展

陳熙，李海龍

（甘肅中醫藥大學第一臨床醫學院，甘肅 蘭州 730000）

0 引言

肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC）是消化系統常見的腫瘤之一，其發病率在全世界惡性腫瘤中排名第六，并且仍然呈上升的趨勢[1]。全球每年有100萬新發的HCC患者，其中中國占比50%以上[2]。在國內，其發病危險因素主要為HBV、HCV和食用發霉變質的食物，而國外則以酒精性肝病和脂肪性肝病最為常見[3]。由于缺乏有效的藥物和治療方法，其死亡率仍在逐年上升，這主要是由于HCC是一個強侵入性的癌癥，與侵入血管和血行轉移相關。所以，深入研究HCC侵襲轉移的發病機理對于改善病人不良預后，提高病人生存期有極大的意義。

HCC是一種多因素共同作用導致的疾病，涉及轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）β信號通路、Wnt/β-catenin信號通路、大鼠肉瘤蛋白（Rat sarcoma，Ras）/絲裂原活化蛋白 激 酶（Mitogen activated protein kinase，MAPK）信號通路和Notch信號通路等。上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是細胞表型從上皮向間質轉變，并伴隨上皮和間質標志物（如 VI、上皮型鈣黏蛋白、神經型鈣黏蛋白、Slug、Snail和 Twist1）的變化，其與 HCC進展有關[4]。HCC具有惡性增殖和侵襲能力，在轉移過程中，單個腫瘤細胞在EMT后，進入血液循環，隨后擴散至其他部位[4]。本文將從幾種不同途徑詳述誘發和控制EMT對HCC侵襲、轉移過程的影響。

1 EMT的概念

EMT過程是可逆的，是上皮在某些條件下失去極后轉化為間質細胞的過程，這些間質細胞在不同的條件下可恢復至上皮狀態，稱為間質-上皮轉化[5]。EMT參與胚胎形成，如組織形態、原腸的形成和出生后組織傷口的愈合等[6]。EMT可促進腫瘤的轉移，主要通過增強癌細胞的遷移、侵襲和對凋亡刺激的抵抗力，并且EMT來源的腫瘤細胞具有干細胞特性和顯著的耐藥性[7]。EMT的發生涉及不同的因子和通路，包括TGF-β、表皮生長因子、Notch信號通路、成纖維細胞生長因子、骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)和肝細胞生長因子等[8]。EMT來源的腫瘤細胞既有形態學改變，又有分子學改變，如上皮細胞標志物(ZO-1、occludin和上皮型鈣黏蛋白)表達降低、間質標志物(vientin、纖維連接蛋白、神經型鈣黏蛋白和成纖維細胞特異性蛋白1)表達增加[7]，此外Twist、表觀遺傳調節因子、miRNAs和Zeb也在隨之而變化著[9]。

2 HCC與上皮間質轉化的關系

2.1 TGF-β在HCC上皮間質轉化中的作用

TGF-β是一種多效細胞因子，根據哺乳動物的基因組，該家族由33個成員組成[10]。根據序列和結構的相似性，這些蛋白質大致分為兩個亞家族，BMP和生長分化因子屬于BMP亞類，而TGF-β、激活素、結節蛋白和左轉運蛋白屬于TGF-β亞家族[11]。其中TGF-β是20世紀80年代第一個被純化和克隆的，也是研究最廣泛的[12]。早期階段，TGF-β在可通過誘導細胞停滯和凋亡來抑制肝臟腫瘤的發生，但其在晚期階段可通過增強癌細胞存活、EMT、遷移、侵襲和最終轉移來促進惡性進展[13]。TGF-β可誘導HCC發生EMT，增加間質細胞基因（如CD44）的表達，并維持上皮基因的表達；與干細胞相比，這些混合的上皮-間質細胞具有更高的干細胞特性[14]。在HCC患者樣本中，TGF-β1的表達與EMT中間質基因的增加有關，而與上皮基因的維持或過度表達無關[14]。

異常的TGF-β信號傳導與EMT和癌癥的發生相關，TGF-β 依賴于 Ras和MAPK途徑來誘導EMT，Ras響應元件結合蛋白 1（RREB1）提供了Ras和 TGF-β 通路之間的分子聯系，用于協調誘導EMT和細胞的纖維化[15]。RREB1是一種 Ras轉錄效應子，是 EMT 中 TGF-β 激活的 Smad轉錄因子的關鍵因子[16]。MAPK 激活的 RREB1 將TGF-β 激活的 Smad因子募集到 Snail；在癌細胞中，Smad和RREB1 直接驅動 Snail和纖維化因子的表達，刺激肌成纖維細胞，促進腫瘤細胞內纖維化，并支持腫瘤細胞的生長[16]。TGF-β下游的非Smad依賴性通路在EMT 的發生和發展中也扮演重要角色，如 Wnt/β-cateni、Notch、MAPK、PI3K/Akt、MEK/ERK 和 JNK 等[17]。

2.2 Wnt/β-catenin信號通路在HCC上皮間質轉化中的作用

Wnt/β-catenin 信號通過調節細胞增殖、分化和遺傳穩定性來控制生命早期的幾個發育過程和成熟組織的穩態，并將成體前體細胞維持在多能狀態，這種信號傳導的畸變或突變與人類的多種疾病有關，包括癌癥、骨質疏松癥、神經變性和心臟代謝紊亂[18]。Wnt蛋白作為配體，是一種分泌型糖蛋白，與細胞表面的卷曲家族跨膜受體蛋白Frizzled(FZD)受體相互作用，激活細胞內信號通路[19]。Wnt通路主要包括獨立的(非典型的)和β依賴的(典型的)連環蛋白信號（β-catenin）。非經典的Wnt信號有多種作用機制，包括細胞極性和Ca2+途徑，在胚胎發育、細胞增殖和遷移等多個過程中發揮關鍵作用[20]。

經典的Wnt/β-catenin信號通路在在調節組織發育和維持體內平衡方面起著關鍵作用，它的失調可促進包括HCC在內的各種肝病的發展[21]。β-catenin是典型的Wnt信號通路中一個關鍵的轉錄共激活因子，其有一個手臂重復結構域，可以與E-鈣粘附素結合，形成細胞間的粘附連接，進而調節細胞間的粘附[22]。

通過這種細胞間的作用，該信號通路參與細胞間連接、上皮細胞表型的調節、組織穩態，但該信號途徑的損傷可能導致 EMT[4]。經典的Wnt/β-catenin通路激活時β-catenin增多，它參與TCF/LEFLegless-PYGO DNA的調節，形成轉錄激活復合物[23]。該過程涉及許多致癌基因的轉錄調控，包括 MMP7、Myc、細胞周期蛋白 D1、CD44、Twist 和Snail，其中 Snail可調控端粒的分解、細胞間連接穩定性、縫隙連接蛋白的表達和蛋白酶的表達，其表達受Wnt信號介導的EMT調節[4]。

經典Wnt/β-catenin可激活EMT，其中β-catenin的轉位與經典信號通路的激活有關，也是 EMT的標志物[24]。當使用Wnt和細胞外信號調節激酶1/2 （extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2）抑制劑抑制Wnt信號時，也同時抑制了EMT 表型[25]。

2.3 Notch信號通路在HCC上皮間質轉化中的作用

Notch 信號通路參與生理和病理過程，包括腫瘤的發生和胚胎的發育。在癌癥進展中，Notch介導的生物反應涉及多種機制，包括血管生成和EMT[26]。在癌癥進展中，EMT 賦予上皮癌細胞遷移和侵襲特征，主要通過連接蛋白的轉錄抑制實現，其中細胞 - 細胞粘附分子上皮型鈣粘蛋白在幾種侵襲性癌中受到了抑制[27]。在胚胎發育中各種高度保守的信號通路可觸發癌細胞中的 EMT，在這些通路中，Wnt、TGF-β 和 Notch 信號在誘導上皮型鈣粘蛋白的直接轉錄抑制物（包括Twist 、Zeb1/2和Snail/Slug）時共同發揮作用[27,28]。研究表明，Snail/Slug 的表達可通過與各種信號通路互相作用來上調Notch信號通路介導的EMT，這些相互作用的信號包括TGF-β、缺氧和雌激素/ G蛋白偶聯雌激素受體（G protein-coupld estrogen receptor, GPER）[26]。Snail是導致 EMT的多個信號通路的下游因子，其表達與不同類型腫瘤的轉移和不良預后呈正相關[28]。在不同類型的癌細胞中，Notch 信號可通過直接誘導Snail 表達來促進EMT[26]。在轉錄水平上，Notch 通過三方復合體NICD-CSL-MAML-1調節Snail 表達，而MAML-1的顯性負突變體 (DN-MAML-1)則可抑制癌細胞中的Snail 表達和 EMT[29]。Notch 還可通過一種間接機制來控制 Snail 蛋白的表達，該機制增強了缺氧癌細胞中Snail 蛋白的穩定性[26]。

3 其他

除以上兩種重要信號通路外，一些蛋白的表達也可通過信號通路來促進HCC發生EMT，如線粒體鈣單向轉運體調節分子1（mitochondrial calcium uniporter regulator 1，MCUR1）、單過性跨膜蛋白（Nicastrin，NCSTN）、CD24、G 蛋白偶聯受體激酶相互作用蛋白-1（G-protein-coupled receptor interacting protein 1，GIT1）、缺氧誘導因子-1（hypoxia-inducible factor-1, HIF-1）α和腫瘤干細胞（Cancer stem cells，CSCs）等。

3.1 MCUR1在HCC上皮間質轉化中的作用

MCUR1 在HCC中長期處于高水平表達，并促進癌細胞存活，其在有轉移的HCC中的表達明顯增高，且與腫瘤的進展有關。MCUR1可通過Snail促進EMT，進而促進HCC的體外侵襲和體內轉移。其介導的線粒體Ca2+信號可通過激活ROS/Nrf2/Notch1通路促進HCC相關的EMT，抑制線粒體Ca2+攝取、ROS產生、Nrf2表達或Notch1活性可顯著抑制MCUR1誘導EMT和HCC轉移[30]。

3.2 NCSTN在HCC上皮間質轉化中的作用

NCSTN是 γ-分泌酶的核心亞基，其在腫瘤進展中起著至關重要的作用，與正常肝組織相比，其在HCC中顯著升高；其可通過上調 Zeb1 誘導EMT，主要機制為：（1）NCSTN 促進了 β-catenin 的核易位，β-catenin 是 Zeb1 的正轉錄調節因子；（2）NCSTN 可通過Notch1 和PI3K/AKT 信號通路促進 β-catenin 激活，并通過切割 Notch1 增加 AKT和糖原合酶激酶3（glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β）磷酸化，從而減少 GSK-3β/β-catenin 復合物；（3）GSK-3β的失活抑制了β-catenin的降解，促進了β-catenin的核轉位，啟動了Zeb1的轉錄，導致了惡性表型[31]。

3.3 CD24在HCC上皮間質轉化中的作用

CD24 是一種細胞表面蛋白，由包含27個氨基酸的核心蛋白組成，并通過磷脂酰肌醇與細胞膜結合[32]。CD24主要由免疫細胞表達，但通常在人類腫瘤中過表達，其與HCC的遷移、侵襲和增殖有關，并可作為CSCs的標記物[33]。Wan等[34]研究指出，CD24 參與HCC的發生，其在HCC中的mRNA 和蛋白質水平都呈高水平表達，可誘導EMT和促進Notch信號通路介導的EMT，進而誘導樹突狀細胞的激活和抑制抗腫瘤免疫反應（導致CD4+T和CD8+T細胞的比例明顯降低、細胞因子水平升高）來調節腫瘤微環境，促進HCC的發生[34]。

3.4 HIF-1α在HCC上皮間質轉化中的作用

CSCs是可自我更新的一類細胞，可出現在許多實體和非實體腫瘤中，其與腫瘤的發生、轉移、耐藥和復發有關，Wnt/β-catenin、Hedgehog、TGF-β和Notch信號參與CSCs的自我更新過程[35]。EMT和CSCs在腫瘤的發生和進展中有共性[36]。

缺氧是腫瘤環境中始終存在的一種情況，主要是由于人體沒有足夠的血液支持腫瘤細胞的快速生長，其在腫瘤細胞的休眠、代謝、干細胞活性、轉移中起重要作用，同時這種環境導致了HIF-1α的產生，這種因子是一種螺旋轉錄因子，其可參與血管生成、糖酵解和腫瘤的生長[37]。缺氧和HIF-1α可以誘導HCC發生EMT，并增加HCC的耐藥性[38]。Jing等[36]研究發現HIF-1α誘導肝癌細胞發生EMT，促進了HCC的CSCs特性，并且這一過程是由NICD和Notch1信號通路共同作用導致的；HIF-1α和Notch1在肝癌組織和化學誘導HCC模型中的表達均升高。

3.5 GIT1在HCC上皮間質轉化中的作用

GIT1是GIT家族的成員，包括多種功能結構域，一種多功能支架蛋白[39]。GIT1具有多種生物功能，如調節受體內吞、細胞運動、細胞形態、血管生成和神經功能等，其表達增加可促進肝、結腸、黑色素瘤、肺和腎腫瘤細胞的遷移、侵襲和轉移[40]。GIT1對局灶性細胞遷移、粘附和片狀脂質體的形成至關重要，可調節多條信號通路，包括MEK1/2-ERK1/2、NF-κB和Notch信號通路[41,42]Wang等研究表明：（1）GIT1在HCC組織中表達高于癌旁正常組織，可加速HCC的轉移、增殖和侵襲，并促進體內腫瘤的形成；（2）其可通過激活ERK1/2信號正向調節EMT促進腫瘤的進展，是HCC預后不良的預測因子，與腫瘤的大小和栓子有關；（3）ERK1/2抑制劑（SCH772984）可減弱GIT1過表達引起的EMT改變[43]。

4 展望

EMT參與HCC的全過程，其受多種信號通路調節，在多種細胞因子的共同作用下促進細胞的癌變。從不同的信號通路給予相應的抑制劑可起到阻礙EMT的作用，但目前臨床中對HCC的轉移預防仍處于薄弱階段，需要進一步研究肝癌EMT的相關機制，以尋求新的轉機。