低場核磁共振波譜儀快速測定飲料酒中酒精度

許紫薇，馮翠萍，樊雙喜，張柏林，趙宏飛，劉一諾，岳紅衛，吉鑫，張松祥，陸瑋，王道兵，卜凡，鐘其頂*

1(北京林業大學 生物科學與技術學院，北京，100091)2(中輕檢驗認證有限公司，北京，100015) 3(安徽古井貢股份有限公司，安徽 亳州，236800)4(中國食品發酵工業研究院有限公司，北京，100015) 5(泰科施普(北京)技術有限公司，北京，100039)

GB/T 17204—2008《飲料酒分類》中將飲料酒定義為酒精度在0.5%(體積分數)以上的酒精飲料，包括各種發酵酒、蒸餾酒及配制酒，如黃酒、啤酒、果酒、葡萄酒、白酒、白蘭地、威士忌、伏特加、朗姆酒和露酒等。酒精度是飲料酒的一項重要質量指標，是影響酒類產品等級及口感的重要因素[1]。以酒精度為標準可將白酒分為高度白酒、中度白酒和低度白酒。研究顯示，酒精度是影響濃香型白酒中總酸總酯含量的重要因素之一[2]。目前，國家有關部門根據食品質量法、食品安全法加強了酒類產品的抽檢力度，酒精度是其中的重要指標[3]。

現行飲料酒中酒精度的測定方法依據GB 5009.225—2016《食品安全國家標準 酒中乙醇濃度的測定》。其中，密度瓶法適用于蒸餾酒、發酵酒和配制酒，儀器成本低、便于普及，但操作繁瑣、對溫度敏感[4]；酒精計法適用于酒精、蒸餾酒、發酵酒和配制酒(除啤酒外)，儀器操作簡單，但易受酒中其他成分干擾、對溫度敏感[5]；氣相色譜法適用于葡萄酒、果酒和啤酒，儀器穩定，但測定酒精度高的飲料酒時需蒸餾和稀釋，操作繁瑣；數字密度計法適用于啤酒、白蘭地、威士忌和伏特加，測試快速、簡單，但需蒸餾法除去不揮發物質，前處理復雜、樣品用量大。此外，王超等[6]利用直接酒精計法測定了不含糖露酒的酒精度，但無法準確測定其他酒體含量復雜的飲料酒，樣品用量大。近紅外光譜法適用于發酵酒和蒸餾酒酒精度的測定[7-8]，但在實際測定中，樣品中水分掩蓋了其他成分的吸收信號，對測定結果有一定影響[5,9]，且需蒸餾操作，測試過程相對復雜費時。綜上，目前實驗室中常用測定飲料酒中酒精度的方法，大都需要預先對飲料酒進行蒸餾處理，且實際檢測過程中實驗操作人員的熟練度對測定結果的影響很大。

定量核磁共振技術(quantitative nuclear magnetic resonance, QNMR)是一種十分有效的定量技術，具有前處理簡單、樣品用量少、可同步進行定性和定量分析的優點[10]。目前，QNMR已經廣泛應用于制藥、食品、生命科學、化工等行業，并被各國藥典收錄[3]。QNMR在啤酒[11-12]、葡萄酒[13]、白酒[14-15]、黃酒[16]等飲料酒中均有相關應用研究，如CAO等[11]用QNMR定量液體飲料中的蔗糖，欒曉菲等[12]用QNMR定量分析了啤酒中28種主要成分。

本文采用臺式低場(60 MHz)核磁共振波譜儀對飲料酒中酒精度進行定量分析，基于一維核磁共振氫譜(1H nuclear magnetic resonance,1H NMR)技術對飲料酒中酒精度測定方法進行了研究，并對代表性的幾種飲料酒(白酒、啤酒、葡萄酒、櫻桃發酵酒)酒精度測定方法做了方法驗證，以期開發出一種簡單、快速、準確性好的飲料酒中酒精度測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

檸檬酸(99%)、琥珀酸(99%)，Sigma-Aldrich公司；無水乙醇(分析純)，天津市致遠化學試劑有限公司；重水(99.9%)，北京伊諾凱科技有限公司；白酒樣品購于某電商平臺，含濃香型、濃香醬香兼香型和醬香型3種香型4個樣品；啤酒樣品購于某超市，共4個樣品；葡萄酒樣品和櫻桃發酵酒樣品購于某電商平臺。

NMReady-60PRO高性能60 MHz基準核磁共振波譜儀，Nanalysis公司；AB204-N天平，瑞士Mettler Toledo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乙醇標準溶液、檸檬酸溶液及琥珀酸溶液配制

乙醇標準溶液：用無水乙醇和水配制成體積分數分別為0.5%、2.5%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇水溶液。

白酒測定的檸檬酸外標溶液：稱取檸檬酸4 g(精確到0.01 mg)，用水定容到10 mL。

啤酒、葡萄酒和櫻桃發酵酒測定的檸檬酸外標溶液：稱取檸檬酸1 g(精確到0.01 mg)，用水定容到10 mL。

檸檬酸內標溶液：稱取檸檬酸4 g(精確到0.01 mg)，用重水定容到10 mL。

琥珀酸內標溶液：稱取琥珀酸0.4 g(精確到0.01 mg)，用重水定容到10 mL。

1.2.2 上機樣品制備

標曲法：取500 μL酒樣加入到2 mL 離心管中，再加入500 μL重水，混勻后取600 μL于核磁管中待測。用同樣的方法制備乙醇標準溶液上機樣品。

外標法：取500 μL酒樣加入到2 mL 離心管中，再加入500 μL重水，混勻后取600 μL于核磁管中待測。用同樣的方法制備檸檬酸外標液上機樣品。

內標法：取500 μL酒樣加入到2 mL 離心管中，再加入500 μL檸檬酸或琥珀酸內標液，混勻后取600 μL于核磁管中待測。

1.2.31H NMR測定參數

空掃次數：0次；掃描次數：16次；譜寬：8 000 Hz；激發中心：標曲法和外標法中標準樣品和酒樣品激發中心位置為乙醇甲基的出峰位置δ1.0，白酒測定的外標樣品為δ2.45，啤酒、葡萄酒、櫻桃發酵酒測定的外標樣品為δ2.85。內標法中激發中心位置為內標樣品出峰位置和乙醇甲基出峰位置的中間位置δ1.50；接收增益：14；檢測脈沖：激發角度為90°的單脈沖；弛豫時間：標曲法和外標法測定時，白酒、啤酒、葡萄酒、櫻桃發酵酒酒精度測定弛豫延遲時間(D1)分別為10、30、15、15 s，內標法分別為10、30、25、25 s；采樣點數：4 096。

1.2.41H NMR譜圖預處理

使用MestReNova12.0軟件(Mestrelab Research S.L.，MestReNova(Mnova)NMR，USA)對測試所得原始數據進行傅里葉變換、相位校正、基線校正及定標處理，將乙醇甲基的化學位移定為δ1.00，檸檬酸外標溶液中沒有乙醇，將H2O的化學位移定為δ4.79。

1.2.5 精密度分析

隨機取1份樣品，在1 d內分別用標曲法、外標法、內標法重復測定5次，求相對標準偏差，分析日內精密度；隨機取1份樣品，在5 d內分別用標曲法、外標法、內標法重復測定5次，求相對標準偏差，分析日間精密度。

1.2.6 加標回收率分析

取1份樣品，加入4份不同濃度水平的乙醇，每個濃度水平分別用外標法、內標法、標曲法分別測定2次，測定結果取平均值，分別計算加標回收率。

1.2.7 準確性分析

將標曲法、外標法、內標法測定結果與GB 5009.225—2016《食品安全國家標準 酒中乙醇濃度的測定》中數字密度計法測定結果進行對比分析。

2 結果與分析

2.1 定量方法選擇

核磁常用的定量方法有標曲法、外標法和內標法。標曲法需要配制系列標準樣品，標準樣品需要模擬待測樣品，不確定度高，但無需選擇外標樣品和內標樣品。外標法無需考慮外標物質與待測物是否相互影響，在保證外標樣品不變質的前提下可以多次重復使用，但需要同時測試樣品和外標的90°脈沖寬度和定量1H NMR，不確定度也相對較高。內標法定量不確定度優于標曲法和外標法，內標物和待測樣品只需經過1次檢測即可，但需仔細選擇內標物質以避免內標物質和待測物之間的相互作用，導致信號重疊，內標物質和待測物必須可溶于所選的核磁共振溶劑中。

本研究分別采用標曲法、外標法和內標法對飲料酒的酒精度檢測方法進行了研究。

2.1.1 標曲法

將乙醇標準液定量1H NMR的定量峰積分面積的絕對值為橫坐標，乙醇標準液的濃度為縱坐標，得到線性回歸方程y=αx+β，再用相同方法得到待測樣品的定量1H NMR定量峰積分面積的絕對值，用插值法得到樣品中酒精度。乙醇標準液和待測樣品的測試參數和處理參數必須完全一致。

2.1.2 外標法

PULCON外標法定量使用外部參考樣品，將外部參考樣品的校準轉移到實際樣品中，因此無需考慮分析物和參考樣品之間的相互作用和信號重疊。此外，采用PULCON外標法成本相對較低，可重復多次利用，進一步降低了核磁共振的檢測成本，簡化了前處理操作。檸檬酸結構簡單，性質穩定，易溶于水，如圖1所示以水做溶劑的1H NMR譜僅在δ2.44處有檸檬酸2個亞甲基的4個氫的一組峰，用于定量分析結果準確，因此選擇檸檬酸作為外部參考物，用公式(1)計算待測物的含量。

(1)

式中：C，分析物質量濃度，mg/L；A，絕對積分面積；M，相對分子質量，Da；nH，質子數；NS，掃描次數；P1，1H 90°脈沖寬度；T，檢測溫度，℃；下標Q表示外部參考樣品；下標S表示待測分析物。

2.1.3 內標法

內標法定量需在樣品溶液中加入一定量的內部參考物，在充分弛豫的條件下，核磁共振信號強度(峰面積)與產生該信號的原子的數目成正比，而與其化學性質和所處的化學環境無關。琥珀酸化學性質穩定，不與酒中物質發生反應，在水中有較高的溶解度，其水溶液的1H NMR譜只有一組峰，代表4個氫原子，由圖1可知，其信號不與啤酒、葡萄酒、櫻桃發酵酒中乙醇信號峰發生重疊，和乙醇的信號基線分離良好，所以選用琥珀酸作為酒精度較低飲料酒的內標物質。白酒中酒精度較高，相應的需要內標物質的濃度也要高一些，但琥珀酸在20 ℃時的溶解度為7 g/100 g，對于酒精度一般大于18%vol的白酒，琥珀酸不適合作為內標物質。檸檬酸易溶于水，性質穩定，由圖1可知，檸檬酸的信號δ2.74不和白酒中乙醇的信號重疊，基線分離較好，所以用檸檬酸作為白酒酒精度測定的內標物質。以內標物的相對峰面積作為參考，飲料酒甲基的信號峰作為定量峰，根據公式(2)計算飲料酒中乙醇的濃度。

(2)

式中：C，分析物質量濃度，mg/L；M，相對分子質量,Da；nH，質子數；A，信號積分面積；下標S表示待測分析物；下標Std表示內標物。

圖1 外標檸檬酸和各飲料酒與內標混合溶液的1H NMR譜圖Fig.1 1H NMR spectrum of external standard citric acid and mixed solutions of alcoholic beverages with internal standards

2.2 測試參數優化

核磁共振測試中，弛豫過程分為自旋-晶格弛豫(縱向弛豫)和自旋-自旋弛豫(橫向弛豫)，縱向弛豫時間(T1)一般大于橫向弛豫時間(T2)。弛豫延遲時間(D1)是QNMR中非常重要的一個參數，弛豫延遲時間設置太短會導致縱向磁化矢量不能完全恢復[18]，使定量峰的積分面積不能代表實際質子數，從而影響定量的準確性，但弛豫延遲時間設置過長又會導致測試時間過長。本文采用反轉恢復法測定了標曲法和外標法中白酒、啤酒、葡萄酒、櫻桃酒樣品中乙醇的甲基、亞甲基和外標檸檬酸樣品的T1，以及內標法中白酒、啤酒、葡萄酒、櫻桃酒樣品中乙醇的甲基、亞甲基及內標物質的T1，設置D1為定量峰T1的5倍[19]，以達到準確定量的目的，測定結果見表1。使用標曲法和外標法測定時，白酒、啤酒、葡萄酒、櫻桃發酵酒酒精度測定時D1分別設為10、30、15、15 s，內標法分別為10、30、25、25 s。

表1 T1測定結果Table 1 T1 determination results

激發中心位置(o1p)在標曲法和外標法中為定量峰的出峰位置，對于內標法而言為內標物質的出峰位置和乙醇定量峰的中間位置。接收增益值既不能太大也不能太小，太大數據會溢出，太小會影響定量的靈敏度，通過儀器計算發現增益值為14較合適。

需要特別說明的是標曲法中標準樣品和待測樣品所有測試參數必須保持完全一致；外標法中外標樣品和待測樣品的所有測試參數必須保持一致。

2.3 定量峰和積分區域的選擇

定量峰應包含的質子數多、峰裂分少，才能使定量靈敏度高。定量峰所代表的基團T1時間應相對較短，測試時間才能短。乙醇的甲基信號峰相比亞甲基包含的質子數多、裂分少，由表1和表2可知T1也較短，所以選用乙醇甲基的信號峰作為定量峰。

積分區域應最大包含定量峰的區域，但不能把定量峰周邊其他雜質峰包含進去，在不把雜質峰包含進去的前提下，一般以定量峰為中點至少向兩邊延伸20倍的半峰寬。使用標曲法及外標法時，乙醇標準液的積分區域為δ1.43～0.30；白酒的積分區域為δ1.29～0.64，啤酒、葡萄酒、櫻桃發酵酒的積分區域分別為δ1.30～0.67、δ1.30～0.65、δ1.30～0.64；白酒測定的外標檸檬酸的積分區域為δ2.82～2.03，啤酒、葡萄酒、櫻桃發酵酒測定的外標檸檬酸的積分區域為δ3.22～2.46。使用內標法時，白酒乙醇甲基積分區域為δ1.30～0.67，內標檸檬酸積分區域為δ3.12～2.31；啤酒、葡萄酒、櫻桃發酵酒乙醇甲基積分區域分別為δ1.30～0.68、δ1.30～0.65、δ1.30～0.66，內標琥珀酸積分區域分別為δ2.63～2.30、δ2.61～2.30、δ2.62～2.30。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性分析

以1.2.3的參數測定1.2.1配制的乙醇標準溶液1H NMR，以乙醇標準液體積分數作為橫坐標，1H NMR中乙醇甲基峰積分面積作為縱坐標，得到線性回歸方程y=10.63x-8.074，R2=0.996 1，可見乙醇體積分數為0.5%～80%時，標曲法測定線性良好。

以外標法測定1.2.1配制的乙醇標準溶液的體積分數為橫坐標，乙醇標準液體積分數為縱坐標，得到線性回歸方程y=1.054 4x-0.610 1，R2=0.996 1，可見乙醇體積分數為0.5%～80%時，外標法線性良好。

以內標法測定1.2.1配制的乙醇標準溶液的體積分數為橫坐標，乙醇標準液體積分數作縱坐標，得到線性回歸方程y=0.953 6x+0.389 8，R2=0.999 5，可見乙醇體積分數為0.5%～80%時，內標法線性良好。

2.4.2 精密度分析

2.4.2.1 日內精密度

白酒、啤酒、葡萄酒、櫻桃發酵酒各取1個樣品，在1 d內每間隔2 h分別用標曲法、外標法和內標法測定酒精度，共測定5次，計算日內精密度，由表2可知，相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)<5%，日內精密度良好，滿足方法準確性要求。

表2 日內精密度(n=5)Table 2 Intra-day precisions (n=5)

續表2

2.4.2.2 日間精密度

白酒、啤酒、葡萄酒、櫻桃發酵酒各取1個樣品，分別用標曲法、外標法和內標法測定，共測定5 d，計算日間精密度。從表3可見，RSD<3%，日間精密度良好，滿足方法準確性要求。

表3 日間精密度(n=5)Table 3 Inter-day precisions (n=5)

2.4.3 回收率分析

白酒、啤酒、葡萄酒、櫻桃發酵酒各取1個樣品，加入4份不同體積分數乙醇(表4)，分別使用標曲法、外標法和內標法對樣品中酒精度進行測定，計算回收率，結果見表4。白酒的加標回收率為94.62%～99.28%；啤酒的加標回收率標曲法和外標法分別為97.81%和100.60%，內標法為83.73%；葡萄酒加標回收率分別為84.67%～97.08%；櫻桃發酵酒加標回收率分別為88.50%～100.25%?？梢妼τ诎拙?、啤酒、葡萄酒、櫻桃發酵酒3種方法的加標回收率均能滿足定量準確性要求。

表4 加標回收率Table 4 Spiked recoveries

續表4

2.4.4 定量限和檢出限

將乙醇標準品樣品1.2.3的測試參數及1.2.4的數據處理條件下得到的譜圖，定量峰乙醇甲基峰信噪比為3時的濃度作為檢出限，信噪比為10時的濃度作為定量限[20-21]，該方法的檢出限為0.08%(體積分數)，定量限為0.26%(體積分數)，可滿足GB/T 17204—2008《飲料酒分類》中規定的酒精度在0.5%(體積分數)以上的酒精飲料酒精度測定要求。

2.4.5 和國標法對比分析

用上述建立的1H NMR標曲法、外標法、內標法和GB 5009.225—2016《食品安全國家標準 酒中乙醇濃度的測定》中第四法-數字密度計法，分別對市售4個白酒、4個啤酒、1個葡萄酒和1個櫻桃發酵酒樣品酒精度進行測定，每個樣品每種方法重復測定6次，測定結果取平均值，結果見表5。以國標法測定結果為橫坐標，分別以本文所建立的1H NMR標曲法、外標法和內標法的測定結果為縱坐標作線性回歸曲線，線性回歸關系R2分別為0.999 8、0.999 7和0.999 7。結果表明，本文所建立的1H NMR法與GB 5009.225—2016《食品安全國家標準 酒中乙醇濃度的測定》中第四法-數字密度計法測定結果誤差在5%以內，滿足方法的可行性驗證要求。

表5 核磁共振波譜法與國標法測定結果比較 單位：%vol

3 結論

本研究采用60 MHz低場臺式核磁共振波譜儀，基于1H NMR定量技術，分別采用標曲法、外標法和內標法對飲料酒的酒精度測定方法進行了研究，選取了具有代表性的飲料酒如白酒、啤酒、葡萄酒、櫻桃發酵酒做了方法驗證，對測定方法的線性、精密度、回收率、檢出限、定量限分別做了考察，并與GB 5009.225—2016《食品安全國家標準 酒中乙醇濃度的測定》中第四法-數字密度計法測定結果進行了對比。

結果表明，在0.5%～80%的濃度范圍內，標曲法、外標法、內標法的線性相關系數R2分別為0.996 1、0.996 1、0.999 5，說明這3種方法線性關系良好。分別用3種方法測定白酒、啤酒、葡萄酒、櫻桃發酵酒的酒精度，日內和日間精密度均<5%。其中，白酒的標曲法、外標法和內標法的加標回收率分別為94.62%、97.91%和99.28%；啤酒的加標回收率分別為97.81%、100.60%和83.73%；葡萄酒的加標回收率分別為97.08%、84.67%、87.62%；櫻桃發酵酒的加標回收率分別為88.50%、100.25%和97.13%?？梢妼τ诎拙?、啤酒、葡萄酒、櫻桃發酵酒，3種方法的加標回收率均能滿足定量準確性要求。該方法的檢出限為0.08%(體積分數)，定量限為0.26%(體積分數)。本文所建立的1H NMR法與GB 5009.225—2016《食品安全國家標準 酒中乙醇濃度的測定》中第四法-數字密度計法測定結果誤差在5%以內，滿足方法的可行性驗證要求?？梢?，基于低場臺式核磁共振波譜儀建立的1H NMR標曲法、外標法、內標法可以用于飲料酒中酒精度的測定，且相比于GB 5009.225—2016《食品安全國家標準 酒中乙醇濃度的測定》中酒精度的測定方法，樣品無需復雜前處理、樣品用量少(僅需500 μL)、測樣時間短(<5 min)。相對于高場核磁共振波譜儀(400 MHz)，低場臺式核磁共振波譜儀體積小、質量輕、便于移動，適合飲料酒中酒精度的快速和規?；治鰷y定。