?；侨パ跄懰嵊绊?型糖尿病小鼠主動脈僵硬度和內皮功能障礙的機制

陳燕芳 張建鋒 劉浩飛

(1鄭州澍青醫學高等?？茖W校臨床醫學系內兒教研室，河南 鄭州 450064；2河南中醫藥大學第一附屬醫院腎病科)

2型糖尿病(T2DM)的患病率持續增長，且經常誘發或者伴發心血管疾病(CVD)〔1～3〕。與T2DM和CVD相關的關鍵事件之一是血管功能障礙的發展，特別是導致T2DM相關CVD的血管功能障礙的兩個組成部分：動脈僵硬和內皮功能障礙〔4～6〕，因此探究其機制成為目前的研究熱點。內質網是代謝的重要調節器。內質網內的功能障礙，廣義上稱為內質網應激，導致未折疊蛋白反應(UPR)，這是一種旨在恢復內質網穩態的適應性途徑〔7〕。盡管UPR是抵抗內質網應激的防線，但UPR有可能在持續刺激中慢性激活，繼而誘發細胞功能障礙〔8,9〕。?；侨パ跄懰?TDCA)已被證明可以緩解與內質網應激相關的心臟代謝疾病〔10,11〕。然而，很少有研究探討內質網應激在糖尿病內皮功能障礙中的作用，本研究探討TDCA對T2DM小鼠內皮功能障礙和動脈僵硬度的影響。

1 資料與方法

1.1研究對象和分組干預 選取30只體重23～25 g的健康雄性SPF級C57BL/6J小鼠隨機平均分為空白對照(CON)組、模型(MD)組和TDCA干預(MD+TDCA)組。3組小鼠均飼養在SPF級實驗動物房，光照時間為12 h，溫度為(25±5)℃，相對濕度為50%～60%，每天正常進食飲水，自由活動。每組小鼠具體干預方法為：(1)CON組用普通飼料喂養。(2)MD組構建T2DM小鼠模型，用高熱量飼料喂養小鼠4 w后，靜脈注射濃度為1%的鏈脲佐菌素30 mg/kg溶液(該溶液用0.1 mol/L、pH=4.2的檸檬酸鹽緩沖液配制而成)，在用藥時間達到1 w后取空腹小鼠尾部血液測空腹血糖水平，當空腹血糖≥16.7 mmol/L時則判斷為造模成功。在建模過程中，CON組小鼠則通過尾部靜脈注射等量的鏈脈佐菌素溶液。(3)MD+TDCA組中T2DM小鼠模型構建方法同MD組，在鏈脲佐菌素用藥1 w后經腹腔注射TDCA，劑量為250 mg/(kg·d)，連續注射4 w，待小鼠長至6個月時通過心臟穿刺抽血法將其致死。

1.2觀察指標

1.2.1標本的制備 首先配制pH=7.4的冰凍生理鹽水〔含0.185 g乙二胺四乙酸(EDTA)〕備用。在小鼠斷頭臺處用異氟烷將所有小鼠麻醉，通過心臟穿刺抽血法將其致死，液氮速凍。其中頸動脈和二級腸系膜動脈均需要在配制好的冰凍生理鹽水中完成切除。

1.2.2血清生化指標 各組小鼠均在喂養4 w后稱量體重，然后取尾部靜脈血液，用放射免疫法測定血清胰島素水平；通過生化分析儀測定空腹血糖水平；胰島素抵抗指數(ISI)計算公式為：ISI=In〔1/(空腹血糖×空腹血清胰島素)〕。

1.2.3主動脈僵硬度 使用脈搏分析系統分析主動脈僵硬程度，指標包括主動脈脈搏波速度(aPWV)、主動脈膨脹度和主動脈脈搏波增強指數。具體操作步驟如下：用濃度為2%的異氟烷將小鼠麻醉后將其仰臥置于加熱板上，用心電圖電極將小鼠腿部完全固定，隨時監測小鼠的心率處于450次/min左右，并根據心率大小調整異氟烷濃度。采用多普勒探針完成上述各指標的測定，其中aPWV=探頭間距離(cm)/時間差(胸部和腹部預注射間，s)。

1.2.4血管內皮功能 根據每條動脈的最大管腔直徑計算擴張百分比，指標包括肱動脈內皮依賴性舒張功能(EDD)和肱動脈非內皮依賴性舒張功能(EID)。

1.2.5實時熒光定量-聚合酶鏈反應(PCR) Trizol(Life Technologies公司，美國)分離主動脈和PVAT RNA。用iScript(Bio-Rad,Hercules公司，美國)從0.25 μg/μl RNA中合成cDNA，反應20 μl。使用icycle和iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad,Hercules公司，美國)進行兩步擴增(95℃ 10 s，60℃退火30 s)，共40個循環。采用數據歸一化法計算mRNA相關基因的表達水平，內皮型一氧化氮合酶(eNOS)上游引物：5′-CGGTCGCTTCAGTCGTCAG-3′，下游：5′-ATGTTCGGCTTCCCATTCTCC-3′；GAPDH上游引物：5′-ACAGTCGAGATGGGATACCCTTACCATTACT-3′，下游：5′-CTGCTGACGTCGAGTGGGC-AA-3′。

1.2.6eNOS蛋白表達水平測定 從小鼠主動脈中提取總蛋白，采用二喹啉甲酸(BCA)法測定eNOS蛋白表達水平，取30 μg蛋白置于聚丙烯酰胺凝膠上完成電泳實驗，然后經過電轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，在常溫下將封閉1 h，然后在4℃的(1∶200)一抗中培養過夜。用TRIS-BU在鹽水中清洗0.1%的Twin-20，與二級抗體(1∶500)在室溫下孵育1 h，然后通過成像儀檢測光密度，通過Western印跡對比分析各條帶的灰度值，分析eNOS蛋白表達水平。

1.3統計學處理 采用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組胸主動脈形態學 CON組主動脈組織完整且內膜光滑，不存在缺損的現象，并且中膜層的平滑肌細胞排列有序，染色后顯而易見，不存在增生的現象。與CON組相比，MD組主動脈組織受損嚴重，尤其是內膜更為顯著，內皮細胞體積增大，中膜層的平滑肌細胞排列無序。MD+TDCA組主動脈組織的各層細胞的排列較MD組整齊，且組織受損情況得到了有效緩解。見圖1。

2.2各組體重、空腹血糖、空腹血清胰島素水平和ISI測定 CON組體重和ISI值高于MD組，空腹血糖和空腹血清胰島素則低于MD組，差異有統計學意義(P<0.05)。而MD+TDCA組與CON組比較，體重及空腹血清胰島素水平無統計學差異(P>0.05)，空腹血糖升高、ISI降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.3各組反映主動脈僵硬度指標比較 CON組主動脈脈搏波增強指數和aPWV介于MD組和MD+TDCA組之間，主動脈膨脹度則顯著低于MD組和MD+TDCA組，差異均有統計學意義(P<0.05)。MD組主動脈膨脹度、主動脈搏動增強指數和aPWV均高于MD+TDCA組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.4各組血管內皮功能評估結果 CON組EDD〔(23.23±2.41)%〕小于MD組〔(35.12±2.13)%〕和MD+TDCA組〔(26.61±3.04)%〕，EID〔(26.42±7.11)%〕高于MD組〔(22.69±3.32)%〕和MD+TDCA組〔(23.35±6.60)%〕，差異均有統計學意義(P<0.05)。而MD組EDD顯著高于MD+TDCA組，EID顯著低于MD+TDCA組(P<0.05)。

2.5實時熒光定量-PCR CON組的eNOS mRNA表達水平(1.15±0.22)顯著高于MD組(0.53±0.05)和MD+TDCA組(1.01±0.03，P<0.05)。MD組eNOS mRNA 表達水平顯著低于MD+TDCA組(P<0.05)。見圖2。

2.6Western印跡檢測eNOS蛋白水平 CON組eNOS蛋白表達水平(1.02±0.16)顯著高于MD組(0.53±0.06)和MD+TDCA組(0.92±0.20，P<0.05)。MD組eNOS蛋白水平顯著低于MD+TDCA組(P<0.05)。見圖3。

3 討 論

有報道表明，內質網應激可能是T2DM相關血管功能障礙的治療靶點，內質網應激已經成為肥胖和T2DM模型中代謝紊亂的新中介〔12～14〕。本研究結果顯示，相對于MD組主動脈組織及內膜受損較為嚴重，MD+TDCA組的主動脈組織受損情況已獲得有效緩解。有研究也報道了內質網應激與TDCA之間的關系〔15～17〕，原因主要考慮是與TDCA的應用產生了較好的干預效果有關〔18～20〕。TDCA可較好地對內質網應激反應產生一定的抑制效果，其主要可能是通過對于T2DM小鼠機體內的微炎癥反應及胰島素相關信號通路的關鍵蛋白進行活化影響而發揮作用〔21～23〕。同時，其優化了小鼠機體的胰島素抵抗狀態，并對血管內皮產生較好的改善作用，因此MD+TDCA組的主動脈組織及內膜均獲得了較好的修復緩解〔24～26〕。有報道證實，高脂飲食誘導的內皮功能障礙和主動脈內質網應激均可被TDCA給藥逆轉〔27～29〕。同時，本研究結果表明，MD+TDCA組的血糖控制水平及胰島素抵抗狀態得到明顯優化，且主動脈僵硬度及血管內皮功能亦獲得了較好的緩解。究其原因，TDCA可有效抑制T2DM小鼠機體肝臟及脂肪組織中的內質網應激，并能改善其機體內的葡萄糖耐受〔30～32〕。同時，TDCA能減少高胰島素血癥的發生概率，強化機體針對胰島素產生的敏感性，進而優化機體內的胰島素抵抗狀態，并能夠抑制c-Jun氨基末端激酶等相關炎癥激酶的活化，從而使血管內皮功能得到明顯地改善〔33～35〕。T2DM模型小鼠的內皮細胞和平滑肌細胞存在廣泛的血管功能障礙，而TDCA可降低T2DM模型小鼠的動脈僵硬度，這與本文的研究結論基本相符。此外，Dell′Aglio等〔36〕、Ni等〔37〕也有類似的報道可加以佐證。

綜上，內質網應激可能是T2DM相關血管功能障礙的新原因和治療靶點，TDCA對T2DM小鼠的主動脈僵硬度及內皮功能障礙具有較好的改善效果。