姜黃素對骨質疏松鼠模型作用機制的研究

王銅浩，田永剛，韓立強，郭樹章

（天津市第三中心醫院骨科/天津市重癥疾病體外生命支持重點實驗室/天津市人工細胞工程技術研究中心/天津市肝膽疾病研究所，天津 300170）

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）是一種代謝性骨骼疾病，主要特征是骨量減少、骨微結構破壞，導致骨脆性增加、易發生骨折。目前根據不同類型骨質疏松研發了多種動物模型，包括去卵巢動物模型、糖尿病性動物模型、糖皮質激素誘導的動物模型、老年癡呆性動物模型、廢用性動物模型等，這些動物模型的建立對骨質疏松發病機制及藥物防治的研究起到了至關重要的作用。近幾年在眾多抗骨質疏松的藥物中，姜黃素的研究及應用得到越來越多的關注。姜黃素是從姜黃根部提煉的最主要的色素成分，是一種歷史悠久并用于治療多種疾病的草本藥物[1]。研究表明[2，3]，姜黃素具有多種藥理學活性，如抗氧化和抗炎作用、降血糖作用、神經保護作用、抗結核作用和抗癌活性，還可以通過促進破骨細胞凋亡和抑制破骨細胞分化而顯著抑制破骨細胞介導的骨吸收[4]。動物模型研究發現，姜黃素通過調控多種細胞因子及信號通路調節骨重塑，提高骨密度，有效治療骨質疏松癥。因此，本文就姜黃素對不同骨質疏松動物模型的治療作用進行綜述，為研究姜黃素治療骨質疏松的藥理機制奠定基礎，并為姜黃素進一步臨床應用提供理論依據。

1 卵巢切除去勢骨質疏松鼠動物模型

絕經后骨質疏松是骨質疏松癥的最常見的一種類型，主要是由于低峰值骨量、激素缺乏以及衰老導致的骨丟失。在雌激素缺乏的狀態，由于骨吸收增加而骨形成減少導致骨小梁數量減少、骨體積分數百分比降低、間距增加[5]。以雙側卵巢摘除（ovariectomize，OVX）形成的骨質疏松大鼠模型可模擬雌激素缺乏時由于破骨細胞功能亢進和骨更新加快而導致的小梁骨過度丟失，已被證實能代表老年女性雌激素缺乏（或絕經后）導致骨丟失的一些最重要臨床特征[6]，也是目前研究原發性骨質疏松最常用的模型，還是目前研究姜黃素體內骨保護作用的主要研究模型[7]。研究發現[8]，隨著年齡的增加，細胞線粒體功能減弱，機體的抗氧化應激系統清除能力下降，活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）生成增多，機體表現為氧化應激，從而誘導成骨細胞的凋亡或死亡，抑制其增殖、分化，減弱成骨細胞的礦化作用，誘發骨質疏松。同時，氧化應激能刺激破骨細胞的形成、分化和骨吸收作用，促進骨質疏松的發生發展。持續的氧化應激可激活NF-κB，促進腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（IL-6）等相關炎癥過度表達，IL-6 是骨吸收明顯的促進劑，促進破骨細胞前體的分化，增加破骨細胞活性，促進骨吸收，而血清TNF-α 水平升高則直接刺激破骨細胞的成熟與活化，并刺激成熟的破骨細胞分泌IL-6[9]，二者共同促進破骨細胞形成，使骨吸收增加，導致骨質疏松發生。除了炎性反應，氧化應激（OS）誘導的骨質疏松功能障礙也是骨質疏松癥的主要病理機制，而姜黃素可通過調控NF-κB/IL-6信號通路作用，從而抑制炎癥反應[10]，并且姜黃素可通過激活叉頭框蛋白O（FoxO）3a/分泌型糖蛋白（Wnt）信號通路，有效緩解氧化應激介導的去卵巢大鼠骨質疏松[11]。另外姜黃素可抑制糖原合成酶激酶（GSK3+）和激活核因子紅細胞2 相關因子2（Nrf2）減少氧化應激，從而有望治療骨質疏松[12]。此類藥理作用可能是姜黃素拮抗卵巢切除致骨質疏松癥的途徑作用之一。除了氧化應激及炎性介導的信號通路之外，骨保護素（OPG）/RANKL 信號通路也是成骨細胞與破骨細胞相互作用機制中較重要的通路，與OP 發病機制密切相關。研究發現姜黃素能夠改善去勢骨質疏松模型大鼠的骨代謝水平，增加其BMD、改善骨小梁微結構、抑制骨吸收,這種作用可能與調控OPG/RANKL 信號通路有關[13]。

除上述機制外，組蛋白賴氨酸甲基轉移酶（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）是骨髓間充質干細胞成骨過程中最突出的表觀遺傳學酶之一，可控制成骨細胞分化。去勢后，EZH2mRNA 在下頜骨和股骨中的相對表達量增加，提示EZH2 mRNA 水平的增加與雌激素的減少有關，而應用姜黃素治療后去勢骨質疏松大鼠體內EZH2mRNA 表達水平顯著下調，骨微結構明顯改善，骨密度增加，說明姜黃素治療去勢大鼠骨質疏松的機制可能與下調EZH2mRNA的表達水平有關[14]。

總之，姜黃素對去勢骨質疏松鼠模型治療主要通過FoxO3a/Wnt 信號，NF-κB/IL-6 信號通路抗氧化、抗炎，通過OPG/RANKL 信號通路調節成骨細胞與破骨細胞平衡，通過升高Axin2 基因，下調EZH2mRNA 表達水平等機制治療絕經后骨質疏松。

2 糖皮質激素誘導的骨質疏松鼠動物模型

長期糖皮質激素治療與骨質疏松癥的發病率有關，骨質疏松癥是糖皮質激素治療最嚴重的副作用之一。糖皮質激素誘導的骨質疏松癥（glucocorticoidinduced osteoporosis，GIOP）主要是由于成骨細胞和骨細胞的凋亡以及破骨細胞生存周期的延長引起，研究表明[15]，成骨細胞凋亡及其導致的骨形成減少和骨脆性增加在糖皮質激素誘導的骨丟失和骨質疏松的發生發展過程中起至關重要的作用。給予大鼠腹腔注射地塞米松能明顯損害股骨骨小梁結構并顯著降低其機械強度，形成激素誘導的骨質疏松鼠模型。Bcl-2 是一種抗凋亡蛋白，在糖皮質激素誘導的成骨細胞凋亡中起重要作用，而Bax 是一種促凋亡蛋白，Bax/Bcl-2的比值在多種細胞生存過程中起“凋亡開關”的作用。研究發現[2]，姜黃素預治療可以顯著扭轉地塞米松對于Bax 表達的促進作用以及對Bcl-2 表達的抑制作用，導致的Bax/Bcl-2 比值降低，從而起到對抗GIOP的作用。Wnt/β-catenin 信號通路在人體的生長、發育和器官功能的維持中起重要作用，成骨細胞中的Wnt/β-catenin 信號通路激活能夠誘導OPG的表達而抑制破骨細胞分化，姜黃素可以通過對MicroRNA（miR-126a-3p）表達的調節，以濃度依賴的方式抑制間充質干細胞分化引，并且通過調控Wnt/β-catenin 信號通路治療骨質疏松[16]。

糖皮質激素可向下調骨蛋白（OPG）和向上調節核因子Kappa-+配體（RANKL）的受體活化劑（RANKL），通過改變RANKL/OPG 軸引起骨質疏松。除此之外，糖皮質激素可以通過下調RunX2 抑制間質干細胞的骨質分化，通過引起氧化應激加速骨細胞凋亡，導致骨細胞增殖抑制[17]，而姜黃素能夠調控OPG/RANKL 信號通路，增加其BMD、改善骨小梁微結構、抑制骨吸收[13]。

基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）是一種依賴鋅的內含酶，在骨生物學中，MMP-9 是由骨細胞產生，在細胞外基質的降解中起著重要作用。研究還發現[18]，MicroRNA（miR）-365 是MMP-9的調節器，可能與糖皮質激素引起的繼發性骨質疏松癥有關，通過姜黃素治療可以抑制MMP-9 在GIOP 小鼠頭骨中的表達，進而激活miR-365，對GIOP 小鼠骨質惡化起到保護作用。

3 老年癡呆性骨質疏松鼠動物模型

老年性癡呆癥又稱阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是臨床上最為常見的老年性疾病，其合并骨質疏松發生比例較高。β-淀粉樣蛋白（Aβ）、APOE4、維生素K 和維生素D 可能是老年癡呆和骨質疏松相互聯系的重要因素[19]。APP/PS1（β 淀粉樣蛋白前體蛋白/早老素1）轉基因鼠大腦皮質內含有類似于AD 患者腦內的Aβ 老年斑，是AD 研究領域的最佳動物模型[20]。研究發現[21]，APP/PS1 轉基因組小鼠脛骨近端骨微結構、骨密度參數與野生型小鼠相比存在明顯的差異，APP/PS1 轉基因組小鼠更易患骨質疏松，應用姜黃素治療后，APP/PS1 轉基因組小鼠骨微結構的明顯改善，骨密度增加，推測可能機制是姜黃素能夠減少Aβ，調節免疫功能，抑制炎癥因子的釋放，進而通過治療AD，達到防治老年癡呆性骨質疏松的目的。Wnt/β-catenin 信號轉導通路是一種重要的信號轉導通路，可調節包括細胞生存在內的許多細胞過程，可抑制淀粉樣蛋白-β的產生，在Alzheimer disease 和骨質疏松的發病過程中起著重要的作用[22]，姜黃素可能通過調控Wnt/β-catenin信號轉導通路治療骨質疏松。除此之外，在AD 轉基因小鼠模型體外和體內檢測均顯示骨組織中Aβ 表達增強，同時骨髓腔內脂肪組織形成增加，同樣在人椎體小梁骨標本中發現信使RNA，Aβ42 和APP的表達明顯增加，而Aβ的增加骨密度的變化存在一定的相關性，其可能原因是異常表達的Aβ 沉積似乎會干擾RANKL 信號級聯，進而影響骨形成和骨吸收之間的平衡，導致骨質疏松[23]?？梢姵搜仔砸蜃?，Aβ 在老年癡呆性骨質疏松發病過程中同樣起到至關重要的作用。姜黃素對APP/PS1 轉基因組小鼠體內炎性因子和Aβ 都有一定清除作用，這可能是姜黃素治療老年癡呆性骨質疏松的主要機制，但還有待進一步研究。

4 廢用性骨質疏松鼠動物模型

廢用性骨質疏松癥（disuse osteoporosis，DOP）是由于機械應力刺激減少所引發，以骨量丟失為主要特征且易發生骨折的疾病，屬繼發性骨質疏松的一種。大鼠尾巴懸吊模型即后肢懸浮模型，該模型由美國宇航局建立，被世界公認為模擬骨丟失的有效廢用性骨質疏松模型[24]。目前對廢用性骨質疏松防治藥物主要以西藥為主，但因副作用大、價格昂貴、藥效不持久，使人們不得不尋找新的藥物替代，中醫藥現在已經成為國內骨科界研究的重點方向。黑木耳肽-鈣復合物（AP-Ca）具有抑制廢用性骨質疏松癥引起的骨丟失的潛力，對廢用性骨質疏松癥引起的骨質丟失具有保護作用，為患者和宇航員減少廢用性骨質疏松癥的風險提供了新的選擇[24]。李凱等[25]研究發現，葛根素對DOP 大鼠模型具有防治作用且效果良好，其作用機制可能與促進骨形成和抑制骨吸收有關。而對于姜黃素的治療近幾年研究較少，姜黃素可大大改善吊尾大鼠引發的骨質丟失，其機制主要與其抑制氧化應激作用有關，而增加維生素D 受體（VDR）的表達也可能是其中一個原因[16]。廢用性骨質疏松有關的信號通路包括RANKL/RANK/OPG 通路、Wnt/β-catenin 通路、PPAR-γ 通路以及戊糖分流通路等[26]，姜黃素對其中的一些信號通路的調控可影響其他類型的骨質疏松，但是否適用于廢用性骨質疏松，還有待進一步研究。

5 糖尿病性骨質疏松鼠動物模型

糖尿病性骨質疏松是一種由糖尿病誘發的慢性骨代謝疾病，約1/2～2/3的糖尿病患者伴有骨強度的下降，其中有近1/3的患者可診斷為骨質疏松。有研究發現，糖尿病大鼠[27]和糖尿病絕經期婦女[28]骨組織中組織蛋白酶K（Cathespin K）的表達水平明顯升高，從而促進破骨細胞的活化和骨吸收增強。因此，Cathespin K 在糖尿病性骨質疏松的發生和發展過程中有重要的作用。馬如風等[29]研究結果表明，姜黃素能夠明顯抑制股骨和脛骨組織中Cathespin K的蛋白表達水平，進而保護高脂誘發的骨質惡化。Hie M 等[30]用鏈脲霉素誘導大鼠糖尿病模型并補充姜黃素，8 d 后獲得骨髓細胞并體外培養，其中糖尿病組大鼠骨髓細胞形成抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）（+）細胞的能力更強。而補充姜黃素可降低TRAP（+）細胞數量至接近對照組水平。結果表明姜黃素通過抑制糖尿病大鼠細胞內c-fos 蛋白和c-jun蛋白表達，從而抑制激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）表達，降低破骨細胞前體數量，從而抑制骨吸收活性的增加。

轉化生長因子-β1（TGF-β1）由成骨細胞分泌，促進成骨細胞分化，抑制骨細胞活性[31]。研究發現[32]，2 型糖尿病大鼠在骨骼受損時表現出較低的TGF-β1表達；然而，增加TGF-β1水平可起到保護骨骼的作用，因為它可減緩骨質流失和延遲糖尿病損傷。應用姜黃素治療糖尿病大鼠可增加骨組織中TGF-β1mRNA 表達，并促進了Smad2/3 磷酸化，表明姜黃素的影響可以通過TGF-β/Smad2/3 通路激活介導，改善骨生物力學特性[33]。

6 總結

姜黃素對原發和繼發性骨折疏松都有一定的治療作用，其作用機制包括姜黃素抗炎，抗氧化的藥理作用，對β-catenin、Bax/Bcl-2、c-fos、c-jun、Aβ 等蛋白和Cathespin K、EZH2、MMP-9 等酶類的調控，以及 對 NF -κB、OPG/RANKL、FoxO3a/Wnt、Wnt/β -catenin、TGF-β/Smad2/3 等信號通路的調控，從而影響體內破骨細胞及成骨細胞的含量，維持骨重塑的動態穩定性，治療骨質疏松。近年來，雖然姜黃素這些藥理作用以及姜黃素的有效性和安全性得到了多方證實，但是其較差的生物利用度仍是目前制約其應用的主要問題。更多骨質疏松動物模型的建立，以及姜黃素進一步藥理機制的研究，將為開發防治骨質疏松的臨床藥物奠定理論基礎，相信不久的將來姜黃素的應用前景會更加廣闊。