鼠類肉瘤病毒癌基因突變型晚期非小細胞肺癌的靶向治療和免疫治療進展

盛津津，馬燕凌

1江漢大學醫學院，武漢430056

2江漢大學附屬湖北省第三人民醫院腫瘤科，武漢4300330

肺癌仍是中國惡性腫瘤患者病死的主要原因[1]，其中最常見的病理類型是非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）。鼠類肉瘤病毒癌基因（kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS）突變是西方國家NSCLC 中最常見的突變類型，約占30%，在亞洲國家中約占10%[2]。近年來，精準靶向治療明顯改善了驅動基因陽性NSCLC 患者的預后，但KRAS突變型NSCLC 患者卻未能從中獲益，雖然免疫治療的飛速發展為此類患者帶來了生存獲益，但療效仍未有定論。目前，針對KRAS突變型NSCLC患者的治療仍然以化療為主，患者的預后較差，面對這一龐大的患者群體，臨床迫切需要給予更多的關注與突破?？上驳氖?，部分研究在KRAS突變型NSCLC患者的靶向治療領域取得了突破，且免疫治療在這類患者的應用上也有了新發現。本文主要以KRAS 抑制劑為切入點，介紹靶向治療和免疫治療在KRAS突變型NSCLC 應用中的研究進展，希望對這一患者群體的個體化治療有所幫助。

1 KRAS 信號通路

大鼠肉瘤癌基因（rat sarcoma oncogene，RAS）是一種原癌基因，包括Harvery 鼠肉瘤病毒癌基因（v-Ha-ras Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog，HRAS）、神經母細胞瘤癌基因（neuroblastoma ras viral oncogene homolog，NRAS）和KRAS，它們編碼4 種高度同源的長度約21 000 Da 的三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）水解酶（guanosine triphosphatase，GTPase）。RAS 蛋白結構由二磷酸鳥苷（guanosine diphosphate，GDP）/GTP 結合域（G 域）和負責膜靶向的C 末端組成[3-4]。與GTP 結合時，RAS 具有生物活性，當GTP 水解為GDP 時，RAS 則失活。研究顯示，多種信號通路相互協作可共同合成數種調節蛋白，而這些調節蛋白又調控著具有生物活性（與GTP 結合）及失活狀態下（與GDP 結合）RAS蛋白的比例[5-7]。在生長因子的刺激下，RAS蛋白與鳥嘌呤核苷酸交換因子（guanine nucleotide-exchange factor，GEF）相互作用，從而分離出與RAS結合的GDP，使GTP 與之結合，從而激活RAS 蛋白的活性[8]；當GTP 相對過剩時，RAS 蛋白會優先結合GTP 來發揮生物學活性[9]。此外，RAS GTPase 激活蛋白（GTPase activating protein，GAP）可通過促進與RAS相結合的GTP水解為GDP，使RAS蛋白失活[8]。

在正常細胞中，RAS 的活性狀態受到復雜的機制調控，主要與一類鳥苷酸交換因子（guanine nucleotide exchange factor，GEF）和GAP 的亞細胞移位相關，如受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）的激活會吸引RAS GEF 的募集，如SOS Ras/Rac 瓜氨酸核苷酸交換因子1（SOS Ras/Rac guanine nucleotide exchange factor 1，SOS1），從而激活細胞膜上的RAS 通路[10]。激活后的RAS 通路會通過促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號通路來促進細胞的生長和增殖[11-12]。正常情況下，RAS信號通路受到嚴格的調控，但當RAS 蛋白出現組成性激活突變時，細胞就會發生惡性轉化[13]。大多數情況下，腫瘤細胞中RAS基因突變會使GAP 介導的GTP 水解過程出現障礙，使RAS 蛋白始終處于活性狀態，從而促進腫瘤細胞的生長[14]。RAS 信號通路需要借助上游調控機制（RTK 通路）、下游調控機制[Src 同源區2 蛋白酪氨酸磷酸酶2（Src homology 2 domain-containing protein-tyrosine phosphatase 2，SHP2）]和細胞外生長因子刺激才能發揮促進細胞生長和增殖的作用[15]。盡管目前的研究表明，上述過程涉及RAS、GEF、SOS1 的相互作用，但關于SHP2 是如何在這些條件下觸發RAS突變的，尚未完全明確[16]。RAS基因突變存在多種亞型，其中KRAS突變發生率最高，約占人類腫瘤中RAS突變的83%[17]，而在所有KRAS突變中，G12 位點突變、G13 位點突變分別占81.5%、14.0%，其他位點突變相對罕見。12 位點和13 位點甘氨酸錯義突變會使GAP 難以與GTP 結合，無法促進GTP 水解，使RAS 蛋白無法失活[18]。G12、G13 位點突變時，KRAS 失活受阻，可使與GTP 結合的具有生物活性的KRAS 蛋白得以累積[19]。

2 針對KRAS 突變的靶向治療

約10%的亞洲NSCLC 患者存在KRAS突變。既往直接針對KRAS 蛋白的藥物研發大多失敗，主要原因包括以下兩個方面：①KRAS 蛋白表面相對光滑，缺乏明確的疏水口袋，使化合物難以與之結合；②KRAS蛋白與GTP親和力極高，因此難有化合物阻斷KRAS 蛋白上的GTP 結合位點[20-22]。既往對KRAS突變NSCLC 的靶向治療主要通過抑制其下游信號元件來間接阻斷整個信號通路，如鼠類肉瘤病毒癌基因同源物B1（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF）突變抑制劑和絲裂原活化蛋白激酶的激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MEK）突變抑制劑，但治療有效率均不高。目前有研究在一些特殊位點的基礎上發現了直接作用于KRAS 信號通路的化合物，研究已經進入臨床試驗階段。

2.1 直接作用于KRAS G12C 的抑制劑

KRASG12C 指KRAS基因12 位點甘氨酸突變為半胱氨酸，約占KRAS突變肺腺癌的50%。半胱氨酸可與KRASG12 位點共價結合，使具有生物活性的KRASG12C 蛋白表面Ⅱ型開關下的特殊變構區域暴露出來[23]。新研發的藥物則以此為靶點，誘導Ⅱ型開關功能紊亂，從而使具有生物活性的KRASG12C 蛋白上的GTP 水解為GDP，使多數KRASG12C 難以與GDP 結合而失去生物活性，從而影響其下游信號通路[24]。通過對上述化合物的拉網式搜索，終于找到一種可能用于臨床的化合物——ARS-853，該化合物是一種針對KRASG12C突變的強效抑制劑，但未能成功驗證其在體內的有效性。在ARS-853 的基礎上進一步研發的RS-1620、AMG-510 和MRTX849 也均顯示出了體內的生物活性，其中，AMG-510 和MRTX849 是RS-1620 的結構衍生物[24]。Klempner 和Hata[25]的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗均驗證了AMG-510、MRTX849 的安全性及有效性，特別是針對NSCLC（該群體中KRASG12C 突變接近15%），50%具有KRASG12C 突變的NSCLC 患者可以從中獲得臨床獲益。2019 年美國臨床腫瘤學會（American Society of Clinical Oncology，ASCO）公布的一項Ⅰ期臨床試驗共納入32 例KRASG12C 突變型腫瘤患者（14 例NSCLC、19 例結直腸癌、2 例闌尾癌），給予AMG-510 口服治療，在10 例可評估的NSCLC 患者中，0 例完全緩解、5 例部分緩解（partial response，PR）、4 例疾病穩定（stable disease，SD），疾病控制率達到了90%（9/10）；在18 例可評估的結直腸癌患者中，13 例SD，26 例患者仍在治療中，9 例已停止治療；患者對AMG-510 的總體耐受性良好，共報道了2 例3 級不良反應（貧血和腹瀉），未出現4 級不良反應[26]。

2.2 KRAS G12C 抑制劑的耐藥性

雖然關于KRASG12C 抑制劑的研究為NSCLC患者的治療帶來了希望，但需注意的是，KRASG12C 抑制劑僅對約50%的KRASG12C 突變型NSCLC 患者有效，還有部分患者初治療效較好，但后續又出現腫瘤復發，也就是說，相當一部分患者對此類藥物存在原發或繼發性耐藥。

部分研究發現，對KRAS 信號通路的低依賴性可能是原發性耐藥的主要原因[27-28]。Singh 等[29]研究發現，KRAS突變腫瘤細胞的增殖可能不僅僅依賴于KRAS突變。Muzumdar 等[30]的研究使用RISPR-Cas9 技術完全敲除了KRAS基因，發現并未影響KRAS突變細胞的生長，這可能是因為存在替代的旁路信號通路，如AKT 信號通路或MAPK/PI3K信號通路。Misale 等[31]通過比較ARS-1620 與曲美替尼處理后的KRAS突變型NSCLC 細胞的存活能力發現，仍有一部分腫瘤細胞對這兩種藥物均耐藥，這可能因為這類細胞主要是受ERK（KRAS 信號通路下游的主要效應器）的影響。盡管不同的細胞模型檢測出的結論稍有不同，但一般來講，腫瘤細胞增殖主要受MAPK/ERK 和PI3K/AKT/雷帕霉素靶蛋白復合物1（mechanistic target of rapamycin kinase complex 1，MTORC1）信號通路的調控[32]，RAS 蛋白與PI3K p110 亞基的相互作用會引起AKT 的活化，但PI3K 的活化卻不僅受RAS 的調控，在大多數KRASG12C 的細胞模型中，AKT 和MTORC1 效應蛋白S6 的磷酸化狀態幾乎不受KRASG12C 抑制劑的影響[33-34]，相反，KRASG12C抑制劑主要通過MAPK/ERK 通路來發揮作用。因此，KRASG12C 抑制劑原發性耐藥的主要原因是腫瘤細胞冗長且并行的信號通路，繞開了KRAS 信號通路來促進腫瘤細胞的生長增殖。此外，還有部分原因是腫瘤細胞同時存在其他基因突變，以及腫瘤細胞存在異質性，這使不同個體對藥物反應會有所不同，甚至是同一個體不同部位的腫瘤對藥物的反應也不盡相同[35]。

關于繼發性耐藥的機制，Xue 等[36]探討KRASG12C 快速耐藥的機制，以及KRASG12C 突變細胞亞群對這類藥物耐藥方式的差異性，結果發現，給予同源肺癌細胞群RS-1620 處理后，細胞群出現凋亡、靜止和快速恢復增殖3 種狀態，通過分析快速恢復增殖的細胞亞群發現，這類細胞通過合成新的KRASG12C 抵抗藥物的作用，而新的KRASG12C 又通過增強對EGFR 和SHP2 信號通路的依賴來維持其活性及對RS-1620 的抵抗狀態。此外，通過KRAS 及其下游原件c-RAF 蛋白與人源極光激酶A（aurora kinase A，AURKA）的相互作用，腫瘤細胞躲過藥物的抑制作用。Ryan 等[37]的研究發現，經RS-1620、AMG-510 治療后，腫瘤細胞被再次快速激活，重新開始增殖的原因是野生型RAS信號通路（包括NRAS 和HRAS）活性增加，激活其下游原件，而KRAS 則保持著抑制狀態。以上兩大研究雖然表現出野生型RAS信號通路對于繼發性耐藥的意義不同，但兩者均發現了RTK-SHP2 激活增加是整個RAS 信號通路重新激活的原因，這也是克服繼發耐藥必須要解決的問題。

3 KRAS 突變的NSCLC 的免疫微環境及免疫治療

KRAS突變不僅與腫瘤細胞的惡性增殖與侵襲相關，還會影響腫瘤免疫微環境（tumor microenvironment，TME），進而影響免疫治療療效[38]。Coelho等[39]的研究顯示，人類肺癌中，RAS 信號通路的激活與程序性死亡受體配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱PD-L1）表達上調有關，PD-L1 表達上調會增強腫瘤細胞的免疫逃逸，這意味著RAS 信號通路的激活可以直接幫助腫瘤細胞進行免疫逃逸。RAS信號通路可以通過調節AU富集區與鋅指蛋白（tristetraprolin，TTP）的結合，來提高PD-L1mRNA 的穩定性，從而上調腫瘤細胞PDL1 蛋白的表達，而TTP 通過PD-L1mRNA 的3'-非翻譯區（3'-untranslational region，3'-UTR）的AU 富集區來對PD-L1 蛋白的表達進行負反饋調節。RAS信號通路的下游MEK可通過MK2蛋白激酶來使TTP 磷酸化而抑制其功能。在體內，TTP 表達的恢復可以通過降解PD-L1mRNA、下調腫瘤細胞PD-L1 的表達來增強抗腫瘤免疫反應，這為KRAS突變NSCLC 的免疫治療提供理論基礎。Dong 等[40]的研究證實了肺腺癌細胞KRAS突變可以顯著上調PD-L1的表達，特別是KRAS和TP53雙突變的患者，可以更好地從PD-1 抑制劑中獲益。Li 等[41]的研究也表明，KRAS突變NSCLC 患者的PD-L1 陽性表達率高于KRAS野生型患者（51%vs36%，OR=1.69，95%CI：1.01～2.84，P=0.045）。

di Magliano和Logsdon[42]通過構建KRAS突變的胰腺癌小鼠模型發現，KRAS突變的腫瘤細胞會分泌炎性介質，影響腫瘤細胞周圍的基質細胞、成纖維細胞及免疫細胞，從而影響TME。Ji等[43]構建了KRASG12D位點突變的肺腺癌小鼠模型，結果發現，KRAS信號通路的激活導致了以不典型增生-腺瘤-腺癌為特點的漸進式惡性改變，且在此細胞系中可以檢測到大量炎癥趨化因子，如巨噬細胞炎性蛋白-2（macrophage inflammatory protein-2，MIP-2）、LIX、KC等，表明KRAS活化與炎癥環境相關。多項研究探討，腫瘤炎性環境與腫瘤發生發展的關系及一些細胞因子[如白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-17C、IL-22、IL-8]和KRAS突變的肺癌之間的聯系，慢性炎性環境可能會導致KRAS基因突變和腫瘤的發生發展，KRAS突變又會加重炎性環境，抵抗化療及免疫治療[44-46]。上述研究不僅探討了KRAS突變NSCLC 的免疫微環境，還為此類患者的治療提供了新方向，是否能夠通過干擾這些細胞因子來改變KRAS突變的NSCLC免疫環境，以改變KRAS突變腫瘤細胞的天然免疫逃逸，增強免疫治療或其他治療的療效，甚至是通過干擾細胞因子的表達來干擾腫瘤的進程，這類問題還需要更多的臨床研究進行驗證。

既往有關KRAS突變患者免疫治療療效的研究較少，且結論不盡相同。Lee 等[47]綜合多項隨機臨床試驗數據分析后顯示，與KRAS野生型NSCLC患者相比，使用免疫檢查點抑制劑患者的中位無進展生存期（progression-free survival，PFS）為2.1個月（95%CI：1.8～3.1 個月），中位總生存期（overall survival，OS）為13.4 個月（95%CI：10.2～17.0 個月），而化療患者的中位PFS 為3.9 個月（95%CI：3.1～4.8個月），中位OS 為8.6 個月（95%CI：6.2～13.4 個月），表明免疫檢查點抑制劑可以顯著延長KRAS突變NSCLC 患者的OS（HR=0.65，95%CI：0.44～0.97，P=0.03）。Kim 等[48]納 入509 例NSCLC 患 者（其 中KRAS突變型138 例，KRAS野生型371 例），隨機分為免疫治療組（接受納武單抗或阿特珠單抗治療）和化療組（接受多西他賽治療），結果顯示，與KRAS野生型NSCLC 患者相比，KRAS突變患者可從免疫治療中獲益，且KRAS基因突變可作為預測免疫治療療效的潛在生物標志物。但另外兩項研究發現，免疫檢查點抑制劑的療效與KRAS突變狀態無關[49-50]。這可能與KRAS 冗長且復雜的信號通路相關，后續可考慮將KRAS突變型腫瘤患者進一步分層來分析其中的關聯。

4 小結與展望

目前，針對KRAS突變型NSCLC 的靶向治療已經取得了很大的突破，過去關于這類患者的靶向治療療效欠佳，且預后較差，但直接針對KRASG12C 位點藥物的出現打破了這一僵局，未來關于這類患者的精準靶向治療有望打開新篇章。免疫治療的快速發展也給這類患者帶來不一樣的希望。KRAS突變型NSCLC 的特殊免疫微環境或可更好地從免疫治療中獲益，且KRAS可能成為免疫治療療效預測的生物標志物，雖然對這類研究尚存在爭議，但未來可能可以通過對KRAS分層來進一步分析取得突破。即使各項研究不斷突破，但抗腫瘤治療的手段依舊有限，且存在耐藥及不良反應不能耐受等問題，因此，抗腫瘤治療應促使所有的治療手段發揮其最大作用，且權衡出最適宜的個體化聯合方案，才能為患者帶來最大的臨床獲益。期待未來對于KRAS突變患者的靶向治療、免疫治療、靶向治療+免疫治療+化療等聯合治療手段的更多研究發現。