線粒體DNA基因組不穩定性在肝細胞癌中的研究進展

劉秋龍 邢金良 高一釗 王珍妮 周凱翔 張召輝 周峰 郭旭

作者單位：712000 咸陽 1陜西中醫藥大學醫學技術學院；710032 西安 2空軍軍醫大學基礎醫學院生理與病理生理教研室；221000 徐州 3中國人民解放軍陸軍第七十一集團軍醫院

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是消化系統最常見的惡性腫瘤之一，其高危人群主要為病毒性肝炎、慢性肝病和肝硬化患者，嚴重威脅人類生命健康［1］。目前，HCC的防治形勢仍然嚴峻，因此亟需尋找高效、靈敏的標志物用于其早期篩查及臨床診斷。近年有研究顯示，線粒體DNA基因組不穩定性（mitochondrial genome instability，mtGI）在HCC的發生和發展過程中發揮重要作用［2］。mtGI是腫瘤細胞的主要特征，主要表現為各種類型的線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）變異。mtDNA變異可分為“質變”和“量變”兩大類，其中“質變”包括單堿基替換（點突變）、片段插入缺失等突變，“量變”主要指拷貝數變異。既往研究多在組織水平層面探索mtDNA變異［3］。然而，近年來越來越多的研究發現，腫瘤組織或轉移灶中的mtDNA可釋放到外周血循環中，因此檢測腫瘤來源的mtDNA變異在腫瘤早期診斷、治療及預后評估等方面具有巨大的應用前景。本課題組前期研究也發現HCC患者血漿及外泌體中存在多種類型mtDNA變異［4-5］。本文就HCC中的mtDNA變異及其在液體活檢中的應用進展進行綜述，以期為HCC防治提供新的借鑒。

1 mtDNA“質變”與HCC

1.1 單堿基替換

腫瘤細胞中存在多種mtDNA突變類型，其中單堿基替換又稱點突變，是mtDNA最常見的突變類型，從來源上可分為體細胞突變和遺傳突變。細胞中的mtDNA具有多拷貝特性，因此mtDNA體細胞突變常呈現“異質性”，即細胞中野生型和突變型mtDNA共存。而mtDNA遺傳突變往往是“同質性”的，即細胞中突變型mtDNA占比為100%。目前已有多項研究分析了HCC患者mtDNA點突變的特征，如本課題組對156例乙型肝炎病毒（HBV）相關HCC（HBV-HCC）患者的mtDNA進行深度測序分析，結果發現HCC組織中mtDNA點突變類型主要為C-T替換與T-C替換兩種形式，其中C-T替換所占比例在HCC組織中高于癌旁組織，而T-C替換趨勢則相反［6］。線粒體基因組由16 569 bp組成，分為編碼區與非編碼區，其中非編碼區是點突變發生頻率最高的區域，主要由D-loop區組成［6］。D-loop區由1 122 bp序列組成，包含mtDNA轉錄與復制的起始位點，因此D-loop區在mtDNA突變研究中備受關注。本課題組還分析了156例HCC組織樣本mtDNA，發現癌組織和癌旁炎癥組織中均存在大量mtDNA異質性體細胞突變，且在癌組織和癌旁炎癥組織中D-loop區的突變密度（突變數量/突變區域長度）遠高于mtDNA的其他區域［6］。但在整個線粒體基因組層面，癌組織mtDNA突變密度明顯少于炎癥組織。然而，在癌組織中會積累更多的高致病性突變，且其突變平均異質性水平明顯高于與炎癥組織，提示這些異質性突變在推動HCC發生發展中可能發揮重要作用。

mtDNA點突變與HCC惡性進展以及患者預后也密切相關，有望成為HCC新型預后評估標志物。LIN等［7］通過一代測序鑒定了25例HCC患者癌組織mtDNA D-loop區多個突變位點，發現12S rRNA（MT-RNR1）基因709位堿基基因型與患者不良預后相關，當709位為A堿基時，其基因編碼的小功能肽MOTS-c表達量明顯較709位為G堿基時低，而MOTS-c低表達有利于腫瘤細胞轉移，從而導致患者不良預后。WANG等［8］對59例HCC患者的92個mtDNA單核苷酸多態性（SNPs）進行分析，發現位于D-loop區146位的T-C遺傳突變可能是HCC患者獨立的生存預測因子，146位等位基因為C堿基的HCC患者術后累積存活率顯著低于146位為T堿基的患者（P=0.047）。本課題組也發現根據D-loop區是否包含mtDNA體細胞突變可有效預測HCC患者預后［6］。

1.2 片段插入缺失

除點突變外，mtDNA片段插入缺失也是腫瘤細胞常見的突變方式。目前已在腫瘤細胞中發現超過100個mtDNA區域存在片段插入缺失，其中關于HCC片段插入的研究也不斷深入。LI等［9］通過對140例接受手術治療的HCC患者腫瘤組織mtDNA測序分析發現，315N和315C的患者中位無腫瘤生存時間分別為12個月和15個月（P=0.016）。HCC組織細胞中常發生的短片段缺失主要為348～356位和298～306位重復序列之間的50 bp片段缺失，而這種缺失在多種類型癌組織中也同樣存在［3］。除此之外，mtDNA的4 977 bp長片段缺失也是癌癥常見的突變［10］，其缺失主要發生在8 470～8 482位和13 447～13 459位兩個重復序列之間，包含了7個氧化磷酸化亞基編碼基因（ATP6、ATP8、COXIII、ND3、ND4L、ND4、ND5）和 5 個 mtRNA編碼基因，因此該片段的缺失會嚴重影響線粒體的正常功能。在HCC中，近年已有研究報道，與正常人相比HCC患者的4 977 bp缺失發生頻率明顯增高（P＜0.05）［11］。但是，YIN等［12］在檢測18例HCC患者癌組織及其癌旁組織D-loop區序列時，發現癌旁組織中4 977 bp缺失的比例遠高于HCC組織，且認為這可能是由于腫瘤細胞大量擴增時，帶有mtDNA缺失的細胞可能存在代謝異常引起。還有研究報道，當細胞中發生4 977 bp缺失的mtDNA比例超過一定范圍，線粒體的跨膜電位、ATP合成、線粒體呼吸鏈中多種酶的合成及氧化磷酸化過程將受嚴重影響，甚至造成呼吸鏈中斷，因此惡性腫瘤細胞在大幅度增殖過程中可能通過凋亡將這些異常細胞淘汰，從而致使發生缺失的細胞所占比例減少［13］。mtDNA片段插入缺失尤其是4 977 bp長片段缺失是HCC發生發展機制研究中的重要內容。

2 mtDNA“量變”與HCC

2.1 腫瘤組織mtDNA拷貝數

線粒體基因組與核基因組不同，每個細胞中包含多個mtDNA拷貝［12］。mtDNA作為電子傳遞鏈的必要模板，其拷貝數在一定程度上決定了線粒體的氧化還原能力，因此mtDNA拷貝數與線粒體功能密切相關。據統計，肝臟組織細胞中平均含有500～2 000個mtDNA拷貝［14］。正常情況下，mtDNA拷貝數往往保持在恒定范圍內，以維持細胞能量水平和基本功能，而在HCC患者癌細胞中常發現mtDNA拷貝數變異。目前研究普遍認為mtDNA拷貝數變異與線粒體內膜活性氧（reactive oxygen species，ROS）增多引起mtDNA氧化損傷有關。當輕度氧化損傷時，為了代償減弱的氧化磷酸化及其他線粒體功能，mtDNA復制轉錄系統活性增強，從而引起拷貝數增加。而當氧化損傷超過mtDNA損傷修復系統代償能力時，mtDNA嚴重損傷而發生廣泛突變，為了清除功能障礙的線粒體，最終觸發線粒體自噬機制，從而導致拷貝數減少［15］。有研究［16］發現HCC患者癌組織mtDNA拷貝數降低與患者預后密切相關。該研究通過分析71例HCC患者癌組織和癌旁組織mtDNA，結果發現67%的HCC患者癌組織mtDNA拷貝數顯著低于癌旁組織；進一步根據癌組織與癌旁組織mtDNA拷貝數比值（≥1或＜1）分組，發現與高mtDNA拷貝數HCC患者相比，低mtDNA拷貝數患者更易出現腫瘤包膜不完整和微血管侵犯，5年生存率也更低?？紤]到D-loop區域在mtDNA復制調控中的關鍵作用，本課題組［6］通過檢測156例HCC患者癌組織mtDNA，證實其mtDNA拷貝數減少與患者不良預后相關，同時在HCC細胞系中探索D-loop突變與mtDNA拷貝數的關系，結果發現，與D-loop未突變的HCC細胞系相比，D-loop突變的HCC細胞系具有更強的增殖、遷移和侵襲能力；進一步通過過表達或敲除線粒體轉錄因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）成功建立mtDNA拷貝數增高和降低的HCC細胞模型，發現mtDNA拷貝數增高的HCC細胞增殖、遷移、侵襲能力減弱，而mtDNA拷貝數降低的HCC細胞增殖、遷移、侵襲能力則增強。提示腫瘤組織D-loop區突變可能通過減少mtDNA拷貝數影響HCC細胞的增殖、侵襲和轉移，進而影響HCC患者的預后［6］。此外，HCC患者癌組織mtDNA的D-loop區突變和mtDNA拷貝數變異往往同時發生，由此判斷D-loop區突變可能是引起mtDNA拷貝數降低的原因之一［3］。由于D-loop區作為mtDNA復制起始區域，而TFAM是維持mtDNA拷貝數的關鍵物質，因此D-loop區突變會影響TFAM對mtDNA的結合以及隨后的復制，從而導致mtDNA數量降低。

2.2 外周血mtDNA拷貝數

如前所述，腫瘤組織mtDNA拷貝數變異與HCC患者預后密切相關，目前越來越多的研究也證實外周血白細胞mtDNA拷貝數具有作為HCC預后風險評估生物標志物的潛力。HOSSAIN等［17］發現，與慢性肝病患者和健康受試者相比，HCC患者外周血白細胞mtDNA拷貝數顯著降低，而慢性肝病患者與健康受試者的白細胞mtDNA拷貝數差異并不顯著。此外，本課題組研究［18］檢測618例HCC患者術前外周血白細胞mtDNA拷貝數，發現白細胞mtDNA拷貝數較高的患者更易復發；同時評估白細胞mtDNA拷貝數與總生存率和無復發生存期的關系，根據mtDNA拷貝數構建了ROC曲線，結果顯示mtDNA拷貝數值為0.98，是OS和RFS的最佳截斷值；與白細胞mtDNA拷貝數低的HCC患者相比，白細胞mtDNA拷貝數高的患者死亡風險和復發風險分別增加約1.89倍和約1.86倍。此外，通過過表達TAFM因子誘導T淋巴母細胞系Jurkat和H9細胞mtDNA增高，發現更高的mtDNA拷貝數可通過增加ROS介導TGF-β1分泌，從而誘導Treg和NK細胞數量降低，最后導致HCC的預后不良。同時，聯合白細胞mtDNA含量和TNM分期預測HCC患者預后，發現TNM Ⅲ/Ⅳ期且具有高mtDNA含量的患者OS和RFS較差，而TNM Ⅰ/Ⅱ期且mtDNA含量低的患者OS和RFS較好。因此，白細胞mtDNA拷貝數能作為TNM分期補充而用于評估HCC進展。

3 mtDNA在HCC液體活檢中的應用

液體活檢是近年來新出現的一種檢測技術，主要圍繞體液中的循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）、循環游離核酸（cfDNA和cfRNA）、細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）、蛋白質以及腫瘤代謝產物進行檢測［19］。與組織活檢相比，液體活檢在無創、實時監測、克服腫瘤異質性等方面具有巨大優勢。其中cfDNA可以分為兩大類，即游離核DNA（cfnDNA）和游離線粒體DNA（cfmtDNA）［20］。既往研究發現cfmtDNA在血漿中的穩定性高于cfnDNA，因此更有利于作為生物標志物進行癌癥診斷與監測［21］。也有研究報道，與乙型肝炎、丙型肝炎在內的肝炎患者及健康人相比較，HCC對應肝炎患者血漿中的cfmtDNA拷貝數均顯著降低。本課題組通過對HCC患者、肝炎患者以及健康人血漿cfmtDNA檢測，觀察到HCC患者血漿cfmtDNA的拷貝數明顯低于健康人和肝炎患者（P＜0.001）［5］；同時本課題組分別檢測了116例HBV-HCC患者及232例HBV肝炎患者血漿cfmtDNA，發現HBV-HCC組血漿cfmtDNA含量顯著低于HBV肝炎組（P=1.7×10-5）［22］；HASHAD等［23］檢測了丙型肝炎病毒相關HCC（HCV-HCC）患者、HCV相關肝硬化患者及健康人血漿cfmtDNA各45例，發現與HCV肝炎組和健康對照組相比，HCV-HCC組的血漿cfmtDNA含量最低（P＜0.001），HCV肝炎組和健康對照組之間無顯著差異（P=0.177）。以上研究結果顯示HCC中的mtDNA常以低拷貝數形式存在，提示血漿cfmtDNA拷貝數有望成為診斷HCC的一種潛在的新型非侵入性生物標志物。

除血漿cfmtDNA拷貝數外，血漿cfmtDNA體細胞突變也是HCC液體活檢的重要研究方向，但如何準確識別血漿中腫瘤來源的DNA突變仍是血漿游離DNA突變應用于腫瘤液體活檢的難點。本課題組［5］通過優化的二代測序技術對5例HCC患者和10例結直腸癌患者的腫瘤組織、癌旁正常組織、外周血白細胞及血漿cfmtDNA進行深度測序，結果僅發現血漿cfmtDNA中存在與癌組織來源的腫瘤特異性突變，同時也發現了血漿cfmtDNA的特有突變，但仍無法判斷其具體來源，有待進一步深入研究。因此，血漿cfmtDNA可能是診斷HCC潛在的新型非侵入性生物標志物。

片段組學是近期液體活檢領域新的發展方向，主要圍繞體液中游離DNA特征進行系統性檢測，包括游離DNA片段長度、分布及DNA片段末端的核苷酸基序等。mtDNA片段組學的研究主要包括cfmtDNA和EV mtDNA。AN等［24］分析了16例HCC患者以及32例健康人的血漿cfmtDNA，發現HCC患者平均cfmtDNA長度分布在109 bp左右，較健康人（142 bp）短；在HCC患者中，血漿cfmtDNA片段大小與患者的腫瘤負荷以及cfDNA濃度呈負相關。既往研究也發現EVs中包含游離mtDNA，通過測序發現其序列可覆蓋整個線粒體基因組［4］。EVs是指從細胞膜上脫落或者由細胞分泌的雙層膜結構的囊泡狀小體，直徑在40～1 000 nm之間。本課題組［4］利用HCC患者、肝炎患者和健康人全基因組數據進行片段大小分析，發現以下特征：cfmtDNA的片段長度集中在80 bp，而EV mtDNA的片段長度集中在130 bp左右；肝炎患者EV mtDNA＞300 bp的比例顯著高于HCC患者和健康人，而HCC患者與健康人之間沒有顯著差異；與健康對照組相比，HCC和肝炎患者的EV mtDNA拷貝數顯著降低，但HCC和肝炎患者EV mtDNA拷貝數無明顯差異，這些研究結果顯示了EV mtDNA拷貝數作為HCC診斷生物標志物的潛在價值。但是，目前關于HCC患者體液中的mtDNA標志物研究仍有限，有待進一步挖掘更具特異性的標志物。

4 小結與展望

近年來，液體活檢技術在新型腫瘤標志物臨床應用中取得突破性進展，其中圍繞體液中的核基因組ctDNA檢測發展最為迅猛，但因其在外周血中豐度低，檢測技術要求高，目前仍未有理想的臨床轉化產品。液體活檢正指向mtDNA的拷貝數、突變及片段組學等方面的研究，不斷為mtDNA作為HCC液體活檢腫瘤標志物提供有力證據，使得具有高突變率、多拷貝數和檢測成本低等優勢的mtDNA有望成為HCC更理想的液體活檢新型標志物。因此，圍繞外周血mtDNA拷貝數變異、突變和片段組進行精準檢測，可能是尋找更有效的HCC診斷、監測及預后評估新方法及新策略的重要方向。相信隨著更為精準的針對mtDNA的二代測序技術發展和機器學習技術的應用，mtDNA變異在HCC中的研究將不斷深入，mtGI相關標志物用于HCC的臨床診斷、治療評估、預后預測將成為可能。