乙酰肝素酶在涎腺腺樣囊性癌中的研究進展

龍琴 綜述 吳發印，夏鵬 審校

遵義醫科大學第五附屬(珠海)醫院口腔頜面外科，廣東 珠海 519100

腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma，ACC)是來源于外分泌腺的惡性腫瘤，約占涎腺惡性腫瘤的22%，是涎腺第二大惡性腫瘤，易沿周圍神經和血管侵襲，局部復發率高，可通過血性轉移導致肺部等遠處轉移[1-2]。治療方法早期以手術切除后輔助局部放療為主。因其特殊的生物學行為，晚期轉移性頭頸ACC的治療目前尚無明確的治療方案，化療仍是一線治療手段，但其治療價值仍存在爭論[3-5]。細胞外基質(extracellular matrix，ECM)和 基 底 膜(basement membrane，BM)是腫瘤細胞侵襲及轉移的重要屏障。硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycans，HSPG)存在于細胞表面和細胞外基質中，是一類由核心蛋白和(乙酰)硫酸肝素(heparan sulfate，HS)多糖鏈組成的蛋白多糖的總稱，通過影響腫瘤細胞增殖、黏附、侵襲和血管生成的信號通路，在癌癥的發生和發展中發揮重要作用[6]。乙酰肝素酶(heparanase，HPSE，HPA)是新近發現并克隆出來的一種內切糖苷酶，可降解糖氨聚糖中的HS側鏈，在腫瘤細胞的侵襲和轉移方面具有重要作用。而關于HPSE在ACC中的表達、侵襲及轉移的關系國內外報道較少。本文就鮮有文獻對HPSE在ACC中的研究進展做一綜述。

1 HPSE的基因定位及蛋白質結構

1975年H??K及其同事在鼠肝臟組織中首次發現HPSE是一種降解HS側鏈的內切糖苷酶[7]。直至1997年VLODAVSKY等[8]從人肝癌及胎盤中分離純化50 kDa HPSE，并報道克隆了編碼這種酶的cDNA和基因。人類HPSE有兩種亞型HPSE1和HPSE2，其中HPSE1是目前腫瘤研究的主要內容，HPSE-2與HPSE-1具有約40%的相似性，但發揮的活性卻不同[9]。在人類中，乙酰肝素酶由單拷貝HPSE基因編碼，該基因位于染色體4q21.3[10]上并通過選擇性剪接表達為兩種mRNA種類，分別是5 kb和1.7 kb[11]。后續學者們對HPSE進行了更為詳細的研究。HPSE是一種內切-β-葡萄糖醛酸酶，屬于糖苷水解家族79，來自糖苷水解家族A。該酶通過水解葡萄糖醛酸(GlcUA，G)和α-D-葡糖胺(GlcN，N)殘基之間的β-1,4-糖苷鍵來降解HS。所有HPSE的三維結構一直難以捉摸，但二級結構預測和建模表明(α/β)8 TIM桶折疊，桶的一側有一個活性位點裂縫[12]，以及兩個假定的關鍵人類HPSE的定位活性位點殘基：Glu225和Glu343，位于活性位點裂隙內[13]。最近，VINADER等[14]建立了一種新的人肝素酶同源性模型，并提出了底物與酶的結合模式和關鍵結合元素，以及參與催化的必需活性位點氨基酸殘基。HPSE在幾乎所有人類腫瘤中都過表達，并且在其過表達與腫瘤細胞的轉移潛力之間觀察到相關性。因此，HPSE被認為對腫瘤細胞的侵襲和轉移具有重要意義，也使其成為抗癌藥物發現的理想靶點。

2 HPSE與腫瘤的關系

2.1 HPSE與腫瘤侵襲與轉移 腫瘤的侵襲及轉移是一個多基因、多因素、多步驟的綜合過程。包括癌細胞從原發灶脫離，侵襲周圍組織，進入循環系統，逃避免疫監視，形成腫瘤血管，在遠處器官形成轉移灶。在轉移過程中的一個關鍵而必需的步驟就是腫瘤細胞穿越ECM和BM形成的天然屏障，侵襲周圍組織及血管。ECM作為一種細胞分泌組裝的蛋白質和多糖的復雜網絡結構，不僅能為細胞提供附著位點和結構支持，還可以為調節細胞活性和器官、組織功能提供重要的生物信息[15]。HPSE通過切斷ECM細胞表面的HS側鏈，使附著在SDC1上的相關生物活性分子被釋放出來，形成HPSE/SDC1軸，驅動生長因子信號傳導和調節細胞行為，并重塑ECM，促進了惡性腫瘤的生長、轉移和血管生成[16]。在很多腫瘤組織中，HPSE的mRNA和蛋白均呈高表達，而在腫瘤周圍正常組織中檢測不到。HPSE存在的細胞更易于被轉移性腫瘤和免疫細胞入侵[17]。而沉默HPSE基因可抑制腫瘤細胞的增殖和轉移，其機制可能與HPSE蛋白或基因可促進腫瘤細胞的增殖和轉移有關。

2.2 HPSE與惡性腫瘤的關系 大量研究顯示HPSE在胃癌[18]、結腸癌[19]、胰腺癌[20]、膀胱癌[21]和宮頸癌[22]中高表達，并與腫瘤浸潤、高淋巴轉移、高遠處轉移、高微血管密度和預后差有關。幽門螺桿菌感染是胃惡性腫瘤最重要的危險因素，一些研究表明，幽門螺桿菌感染通過激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)導致胃腺癌的發生。一旦激活，MAPK就會轉移到細胞核并導致轉錄因子的激活，如NF-κB。最近的一項研究也表明，MAPK途徑的激活與HPSE的表達密切相關[23]。幽門螺桿菌感染胃癌激活MAPK信號，導致HPSE激活，HPSE的表達增高，其侵襲和轉移能力增加[24]。HAO等[25]研究發現肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)和HPSE的高表達與TNM分期、浸潤深度和預后不良呈正相關。在MKN74細胞中，外源性HGF顯著增加了HPSE在mRNA和蛋白質水平的表達。進一步的研究表明HGF首先激活PI3K/Akt信號，NF-κB信號在PI3K/Akt下游被激活，并促進HPSE的表達。然而，當使用c-met、PI3K/Akt或NF-κB信號抑制劑時，HPSE表達顯著降低。這些結果表明HGF可通過PI3K/Akt和下游NF-κB信號調節HPSE的表達，從而促進HPSE表達和隨后的腫瘤轉移。CHEN等[20]觀察到上調的FGF2通過激活PI3K/Akt信號通路來增加下游Palladin蛋白的表達，并導致上皮間質轉化(EMT)的激活。隨后發現EMT促進胰腺癌細胞的遷移和侵襲。HPSE/SDC1軸在FGF2的調節中發揮重要作用，并促進胰腺癌細胞的侵襲和轉移，HPSE/SDC1軸可作為胰腺癌的有效治療靶點。盧書芳等[26]研究發現宮頸癌組織中HPSE表達水平明顯高于正常宮頸組織。HPSE可作為宮頸鱗癌淋巴結轉移的生物學指標。HPSE的表達與宮頸癌的臨床分期、淋巴結轉移、脈管浸潤和預后有關。并通過實驗研究發現HPSE通過影響p53、c-Myc、h-TERT的表達，σ1R下調p53的表達，Rad21作為Wnt/β-catenin通路的守門人，調控細胞周期和XPO1的核輸出功能，Wnt/β-catenin信號通路阻滯劑XAV939通過下調tankyrase、β-catenin及Rad21蛋白的表達，參與宮頸癌的發病機制，增加對鉑類化療藥物的敏感性。

2.3 乙酰肝素酶與血管生成 HPSE具有兩種活性、酶活性和非酶活性，這兩種功能都會影響ECM和BM結構完整性。HPSE二聚體的酶活性由50 kDa和8 kDa非共價連接的亞單位組成，導致ECM重塑，從而導致細胞因子、生長因子和脂蛋白的擴散，增強血管生成、免疫系統激活、凝血、自噬加速等。HPSE的非酶活性與高凝狀態有關，HPSE是組織因子的輔助因子，組織因子通過凝血酶和纖維蛋白升高，最終激活血小板，導致腫瘤內血栓形成[27]。研究表明乙酰肝素酶的上調與腫瘤患者血管密度增加和術后生存期縮短有關[28]。HPSE增強Akt信號，刺激PI3K和p38依賴內皮細胞遷移和入侵。它還通過Src路徑促進VEGF表達。因此，這種酶可以激活內皮細胞，并引起血管生成和生存反應。對HPSE過度表達轉基因小鼠的研究表明，這種酶在正常過程中具有細胞動員、HS周轉、組織血管化和改造等功能[29]。HPSE密切參與血管生成，既直接通過促進內皮細胞的侵入(血管萌芽)，也間接通過釋放HS結合堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)，產生促進bFGF活性的HS降解片段。通過基質膠塞試驗已證明體內乙酰肝素酶的血管生成潛力，Eb T淋巴瘤細胞在用HPSE基因轉染后誘導的新血管形成增加了3～4倍。HPSE促進腫瘤血管生成和轉移的能力使其成為癌癥治療的有希望的靶點[8]。

3 HPSE與ACC

ACC是頜面部涎腺常見的惡性腫瘤，因其侵襲性強、轉移率高的特點，該腫瘤治療及預后不佳。BEN-IZHAK等[30]報道了HPA基因及其表達產物與涎腺惡性腫瘤的發生、侵襲、轉移以及預后的相關性，結果顯示：70%的涎腺惡性腫瘤患者HPA基因表達為陽性，HPA基因的表達水平與涎腺惡性腫瘤細胞的侵襲和轉移能力呈正相關，HPA基因表達為陽性的患者其生存率顯著低于HPA基因表達為陰性的患者。吳祥冰等[31]發現HPA在涎腺惡性腫瘤中的陽性表達率為61.4%，顯著高于其在涎腺良性腫瘤中的陽性表達率(21.4%)，彼此之間有顯著差異。說明HPA在涎腺腫瘤中的表達與腫瘤的病理類型無關，而與腫瘤的良惡性質相關。王新等[32]采用免疫組織化學的方法研究發現涎腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma，SACC)中HPSE的表達高于正常涎腺組織，且HPSE在SACC組織中的表達與患者年齡、原發腫瘤大小及腫瘤原發部位無關，與腫瘤組織分型、神經侵襲及遠處轉移有關，提示HPSE蛋白的高表達可能促進SACC的神經侵襲及遠處轉移。同時王新團隊[33]利用RNA干擾技術沉默人SACC-M細胞中的HPSE的mRNA和蛋白表達，可抑制SACC-M細胞的侵襲和遷移能力。因此推測HPSE在SACC的惡性進展中可能起著相當重要的作用，可能會成為預防和治療ACC侵襲、轉移的新靶點。駱樹瑜[34]采用免疫組化方法檢測42例ACC組織及癌旁組織和5例正常涎腺發現，HPSE在臨床分期為Ⅲ、Ⅳ期ACC患者中的表達明顯高于Ⅰ、Ⅱ期ACC的患者；同時在神經侵襲組的表達高于非神經侵襲組，提示HPA可促進SACC的侵襲轉移，設法干預HPA的表達，可能阻斷SACC的嗜神經侵襲。王尚凱等[35]發現HPA與S-100在腺樣囊性癌蛋白上的表達是一致的，與腫瘤嗜神經侵襲性、局部侵襲性和遠處轉移相關，與患者的年齡、性別和臨床分期無關。這與王新團隊[33]研究的結果是一致的。HPSE與SACC的生長和浸潤轉移密切相關，可作為一項檢測指標，用于SACC的聯合診斷、病情評估、療效觀察和預后預測。HPSE抑制劑及乙酰肝素酶反義寡核苷酸的研究將為SACC的診治提供理論依據。

4 HPSE抑制劑研究進展

大量實驗及研究證實了HPSE在腫瘤侵襲轉移和血管生成發揮重要作用，學者們紛紛把眼光投入對HPSE抑制劑的研究中。HPSE抑制劑包括：肝素類似物、硫酸寡聚糖及寡聚糖類似物、中和抗體、天然藥物等。其中寡聚糖類似物、硫酸乙酰肝素模擬物PI-88成為研究熱點。硫酸乙酰肝素模擬物PI-88是硫酸化寡糖的復雜混合物，在20世紀90年代后期被鑒定為HPSE的有效抑制劑。在臨床前動物模型中，它被證明可以阻斷血管生成、轉移和腫瘤生長，并隨后成為第一個進入癌癥臨床試驗的HPSE抑制劑[36]。PI-88是一種單磷酸化、多硫酸化甘露糖低聚糖的復雜混合物，由來自Pichia holstii NRRL Y-2448磷酸甘露糖的低聚糖磷酸部分(OPF)磺化制備而成。它本質上是一種底物模擬物，通過靜電相互作用與酶的活性位點結合，并阻斷HS底物的訪問[37]。PI-88還阻斷血管生成生長因子(如FGF-1、FGF-2和VEGF)與HS及其受體的相互作用，并刺激內源性抗血管生成蛋白、組織因子途徑抑制劑的釋放[38]。HOSSAIN等[39]通過研究發現，PI-88有效的阻斷了HS的兩個硫酸化位點的活性。PI-88是第一個在癌癥患者的人類臨床試驗中進行評估的乙酰肝素酶抑制劑，最終進展到肝癌切除后的Ⅲ期試驗。盡管有早期的承諾，但它未能達到其主要終點，并且尚未批準使用。然而，其早期臨床和臨床前的成功激發了對下一代HS模擬乙酰肝素酶抑制劑的研究，該抑制劑具有更好的性質和更大的效力。這些努力導致了PG545(匹克西莫德)的發現和選擇，用于臨床開發[40]。PG545不僅是一種有效的乙酰肝素酶抑制劑，而且最近被證明具有免疫調節活性，這可能是其作用機制的關鍵組成部分。PG545最近完成了晚期實體瘤患者的Ⅰa期研究[41]。HS模擬乙酰肝素酶抑制劑在乙酰肝素酶介導的一系列其他適應證中顯示出前景，有待進一步的開發及研究。

5 結語

目前已知HPSE除參與癌癥外，還參與一系列病理學，包括炎癥、糖尿病、骨壞死、肝纖維化、淀粉樣變和阿爾茲海默癥，以及多種病毒的感染和傳播[11，42-44]。HPSE在SACC的增殖、侵襲轉移和血管生成方面均有較大的臨床指導意義。而目前對于HPSE在SACC的侵襲、轉移及血管生成分子機制的研究十分有限，仍有很多問題需要進一步探索研究。隨著分子生物學技術的發展及HPSE研究的逐步深入，HPSE有可能成為評估SACC預后或治療反應的分子標志物，為SACC特定靶向診斷和治療開辟新的途徑，并為SACC的早期診斷及治療提供新的思考方案。未來也仍需進一步開發乙酰肝素酶抑制劑并進行臨床試驗的研究，以明確乙酰肝素酶抑制劑的作用，從而更好地服務于臨床。