兩種產靈菌紅素菌株對東海原甲藻和強壯前溝藻的溶藻活性

崔玉棟，陳鳳嬌，曹常明，莫翠鈞，劉福川

(泉州師范學院 海洋與食品學院, 福建 泉州 362000)

近年來，赤潮的頻繁爆發給海洋生態系統和海洋經濟帶來了巨大損失，引發了越來越多民眾對赤潮治理的關注[1].微生物防治藻華被認為是環保、高效且最有潛力的控藻方法之一.其中，溶藻細菌(Algicidal bacteria)可通過直接溶藻或者間接溶藻的方式來抑制或殺死藻細胞，導致藻細胞溶解，以達到防治藻類水華的目的[2].直接溶藻指的是溶藻細菌通過直接接觸藻細胞或者進入到藻細胞內的方式進攻藻類[3].間接溶藻指溶藻細菌分泌具有溶藻效應的次級代謝物質來溶解藻細胞或者通過與其競爭營養物質從而抑制藻細胞的生長[4].目前，已有確認具有溶藻活性的多種化合物被分離純化，包括抗生素、蛋白質、多肽類、哈爾堿(Harmane)及含氮化合物等[5].

靈菌紅素是化學結構中包含甲氧基吡咯骨架結構的一類天然紅色素的總稱，是一種由細菌產生的次級代謝產物[6-7].靈菌紅素不僅具有抗細菌、抗真菌、抗瘧疾和抗腫瘤等活性，而且針對一些微藻赤潮物種具有良好的溶藻效應[8-10].其中，一種由黏質沙雷氏菌發酵生產并純化之后的靈菌紅素，在濃度為5.0 μg/mL的條件下，在24 h內對新月菱形藻、中肋骨條藻、水華魚腥藻和微小平列藻的殺藻率高達100%[8].另外，霍氏菌屬(Hahella)KA22菌株所產生的靈菌紅素對球形棕囊藻(Phaeocystisglobosa)的半抑制濃度為2.24 μg/mL，并且對赤潮異彎藻(Heterosigmaakashiwo)同樣具有殺滅作用[9].靈菌紅素在高溫和酸性環境下可保持化學穩定性，然而，在自然光和堿性環境中則可被降解.在光強為 30 000 lx的光照下，5.0 μg/mL 黏質沙雷氏菌所產靈菌紅素能夠在36 h內完全分解[8-9].

甲藻是海洋生態系統中最重要的真核浮游植物類群之一，是海洋中僅次于硅藻的初級生產力貢獻者，也是引發有害藻華及合成海洋毒素的主要類群[11].其中，東海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)是中國近海海域最重要的赤潮甲藻物種之一.21世紀以來,在我國近海海域幾乎每年都會爆發大規模赤潮，給我國海洋生態環境及海洋經濟帶來了巨大損失[12].強壯前溝藻(Amphidiniumcarterae)屬裸甲藻目，是一種以巖藻黃素為主要輔助色素的甲藻，能產生溶血性毒素，是一種世界性分布的有害赤潮藻種[13-14].KA22菌株所產生的靈菌紅素對東海原甲藻同樣具有殺滅作用[9]，另外弧菌屬(Vibrio)菌株S-9801所產生的靈菌紅素(C20H25N3O)對東海原甲藻、鏈狀亞歷山大藻和錐狀斯氏藻等幾種甲藻具有一定抑制作用，但對甲藻的抑制作用遠小于對其他門類如定鞭藻、針胞藻和硅藻的抑制作用[15].除此以外，關于產靈菌紅素細菌及靈菌紅素對典型甲藻赤潮物種溶藻活性的研究非常有限.

紅色鄰米草菌(Spartinivicinusruber)S2-4-1H為一株從泉州灣所分離的新型產靈菌紅素菌株，可產生環庚基靈菌紅素(cycloheptylprodigiosin，C22H27N3O)S-1和及庚基靈菌紅素(heptylprodigiosin，C22H29N3O)S-2兩種靈菌紅素[16].而ZooshikellaganghwensisKCTC12044是一株從韓國江華島灘涂沉積物樣品中分離的以靈菌紅素為主要次級代謝產物的細菌[17].本項目將以兩種產靈菌紅素菌株為對象，研究其對于東海原甲藻和強壯前溝藻的溶藻效應,為高效溶藻菌劑的開發提供理論基礎.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用東海原甲藻和強壯前溝藻由廈門大學海洋生態基因組學實驗室提供.藻細胞采用f/2培養基培養，培養溫度為20℃，光暗周期為12 h∶12 h.

實驗所用S.ruberS2-4-1H、Z.ganghwensisKCTC12044菌株及S2-4-1H產生的兩種靈菌紅素S-1(純度≥95%)和S-2(純度≥95%)由泉州師范學院海洋與食品學院應用微生物團隊提供.細菌培養使用的培養基為2216E海洋肉湯(marine broth，MB)培養基.

1.2 實驗方法

1.2.1 藻細胞密度及溶藻率測定 將藻細胞培養體系混合均勻，在超凈工作臺中抽取1 mL藻液，用海水稀釋至適當密度，然后加入10 μL Lugol’s碘液，混合均勻后取100 μL樣品加至浮游植物計數板，在顯微鏡下進行細胞計數，然后根據計數結果和稀釋倍數計算細胞密度.溶藻率或者藻細胞的死亡率，根據不同條件下細胞密度的結果計算得出，其計算公式為溶藻率=[(NC-NT)/NC]×100%.其中:NC為對照組細胞密度;NT為實驗組密度.

1.2.2 藻細胞光合系統II最大光合效率(Fv/Fm)的測量方法Fv/Fm是光合系統II最大光化學量子產量，反映了植物的潛在最大光合能力[18].非脅迫條件下該參數的變化極小，不受物種和生長條件的影響;脅迫條件下該參數明顯下降.Fv/Fm的計算公式為Fv/Fm=(Fm-F0)/Fm.其中:F0是在暗處理后在測量光下獲得的最小熒光值,Fm是暗處理后的藻細胞經過一個短暫而強烈的強光曝光后獲得的最大熒光值,Fv為Fm與F0的差值.取藻細胞樣品稀釋至密度為2×104～3×104個/mL，暗處理20 min，之后使用水樣熒光儀(Water-PAM)對Fm和F0值進行測量.

1.2.4 溶藻活性的研究方法 將藻細胞置于光照培養箱中培養，使其進入到指數生長期，取該時期生長狀態良好的藻細胞進行溶藻活性實驗.將活性良好的藻細胞置于24孔板中，分別加入終濃度為10、20、40 μmol/L的S-1和S-2，每個條件設置3個平行樣品.分別于0、24、48 h取樣進行藻細胞密度的測定，并計算溶藻率.

將在固體平板上活化培養后的單克隆細菌菌落接種至液體培養基，在30 ℃下搖菌培養48 h后獲得細菌菌液，以不同體積比添加至藻類培養體系中進行混合培養實驗，同時添加相應濃度MB培養基以排除MB本身對藻細胞生長的影響.在KCTC12044與東海原甲藻混合培養的實驗中，制備細菌懸液進行添加以完全避免MB培養基對細胞生長的影響.取適量新鮮細菌菌液于50 mL無菌塑料離心管中，高速離心20 min，轉速為12 000 r/min.之后將上清去掉，加入與之前菌液相同體積的無菌海水，將沉淀的細菌細胞重新懸浮起來，獲得細菌懸液.將細菌菌液或懸液以不同的體積比加入培養至對數生長期的藻細胞培養體系中，每個條件設置3個平行樣，置于光照培養箱中培養.每隔12 h對藻細胞密度進行測定，并計算溶藻率，同時測定藻細胞的Fv/Fm值.S2-4-1H與藻細胞混合培養實驗中，每隔24 h對藻細胞進行NPQ的測定.

1.2.5 數據統計性分析 使用 PASW Statistics 18 軟件進行單因素方差分析(analysis of variance, ANOVA)，以此來評估不同實驗條件下的統計學差異的顯著性.圖表中顯示的數據為3個平行處理組的平均值，誤差線為計算得出的標準方差.

2 結果與討論

2.1 靈菌紅素S-1及S-2對東海原甲藻的溶藻活性

靈菌紅素S-1與東海原甲藻細胞混合培養的實驗結果見圖1(a)(c).在24 h內，添加3種濃度S-1的實驗組中藻細胞濃度均顯著下降(P<0.01)，之后藻細胞濃度持續下降(圖1(a));48 h時，3種濃度S-1對藻細胞的溶藻率均可達到90%以上，其中10 μmol/L S-1的溶藻率可高達95%(圖1(c)).然而，另外2種更高濃度的處理條件并未帶來更高的溶藻率，3種條件的藻細胞數目在48 h時并無明顯差異(P>0.05).表明在10 μmol/L下，S-1對東海原甲藻即可達到很好的溶藻效果，但是提高濃度并不能進一步提高其對東海原甲藻的抑制和殺滅作用.

圖1 不同濃度靈菌紅素S1、S2與東海原甲藻混合培養時藻細胞密度和溶藻率的變化

靈菌紅素S-2與東海原甲藻細胞混合培養的結果見圖1(b)(d).在24 h時，3種濃度S-2均未對東海原甲藻細胞產生有效的抑制作用(P>0.05);48 h時，3種不同濃度S-2條件下藻細胞濃度均顯著低于對照組(P< 0.01)，但3種條件之間藻細胞密度并無明顯差異(P>0.05).且48 h內3種濃度的S-2對東海原甲藻細胞的溶藻率均低于60%，表明S-2對東海原甲藻細胞的抑制效果并不理想(圖1(d)).

Hahellasp.KA22所產生的一種戊基靈菌紅素的溶藻實驗表明，當其添加濃度為5 μg/mL(15.5 μmol/L)時，72 h時對東海原甲藻的溶藻率為73.8%[9].而從Vibriosp.S-9801中提取的一種結構相同的靈菌紅素以4 μg/mL(12.4 μmol/L)添加至東海原甲藻培養體系時，30 h內溶藻率未超過60%[15].相比之下，本實驗中所用的庚基靈菌紅素S-2與戊基靈菌紅素對東海原甲藻細胞的溶藻率處于類似的水平，但環庚基靈菌紅素S-1具有明顯更高的溶藻率.S-1和S-2的C原子個數相同，其不同點在于在3個三吡咯環母核以外結構中S-1的長鏈烷基與其中一個吡咯環中的兩個碳原子形成鄰位環化，組成一個八碳的環狀結構，而S-2吡咯環以外的碳原子則為鏈狀結構[16].S-2(C22H29N3O)與以往報道的戊基靈菌紅素(C20H25N3O)結構類似，唯一不同在于在吡咯環以外的鏈狀烷基上，S-2多了兩個碳原子.本實驗的結果表明，環庚基靈菌紅素S-1對東海原甲藻細胞的抑制作用卻明顯高于庚基靈菌紅素S-2和已報道過的戊基靈菌紅素[9,15].對兩種靈菌紅素的抑菌效果研究表明，相對于S-2，S-1對白色念珠菌(CandidaalbicansATCC 10231)和大腸桿菌(EscherichiacoliJCM 1649)同樣具有更高的抑制活性，但S-1和S-2對金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusCMCC 26003)和枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisMCCC1A00693)的抑菌活性差別不大[16].以上研究結合兩種靈菌紅素的溶藻實驗，表明環庚基靈菌紅素相對庚基靈菌紅素針對某些物種具有更高的抑制活性，包括溶藻活性和抑菌活性.靈菌紅素的結構與其生物活性，比如抗腫瘤及免疫抑制活性等有著緊密的關系，尤其是其B吡咯環上的甲氧基與細胞毒性的強弱有著重要影響[20].另外，長鏈烷基在吡咯環C12、C14位形成間位環化的間環靈菌紅素(Metacyloprodigiosin)為所有天然靈菌紅素中抗瘧疾活性最強的一類化合物.然而，并未有報道表明環狀結構靈菌紅素的生物活性必然強于鏈狀結構靈菌紅素，但不可否認的是靈菌紅素的結構必然影響其生物活性，其結構與活性的關系有待于更多不同結構類型靈菌紅素被發現和研究.

2.2 靈菌紅素S-1及S-2對強壯前溝藻的溶藻活性

不同濃度靈菌紅素S1、S2分別與強壯前溝藻混合培養時藻細胞密度和溶藻率的變化如圖2所示.

圖2 不同濃度靈菌紅素S1、S2分別與強壯前溝藻混合培養時藻細胞密度和溶藻率的變化

將靈菌紅素S-1以3種濃度添加至強壯前溝藻培養體系中，24 h時對照組藻細胞密度亦有小幅下降，可能是因為該甲藻沒有細胞壁，在轉接過程中造成部分細胞損傷及死亡;而東海原甲藻具有細胞壁，因此轉接操作對其影響較小，細胞在24 h內即適應并快速增長.而3種條件下的藻細胞密度均顯著低于對照組(P<0.01)，然而在24～48 h，細胞密度反而呈增高趨勢，表明強壯前溝藻細胞的生長并未被有效抑制(圖2(a)).同樣，S-1對藻細胞的溶藻率也是呈先升高后下降的趨勢，在48 h時，3種條件下的溶藻率均不超過35%(圖2(c))，表明濃度40 μmol/L以內的S-1不能對強壯前溝藻細胞產生有效的抑制作用.與S-1類似，將不同濃度的S-2添加至強壯前溝藻細胞培養體系后，藻細胞同樣呈現先降后升的現象(圖2(b));與之相對應，溶藻率也呈現先升高后下降的趨勢，且3種濃度條件下的溶藻率在24 h和48 h均未有顯著差別(P>0.05)，表明濃度40 μmol/L以內的S-2同樣不能有效抑制對強壯前溝藻細胞的生長.

綜上所述，S1和S2均能在24 h內對藻細胞造成一定的殺滅作用，但在后期抑制效果明顯減弱.其原因可能為強壯前溝藻細胞具有某種針對靈菌紅素造成損傷的修復機制，從而抵制了靈菌紅素的傷害.同時，所加的靈菌紅素在光照作用下被部分分解，也引起了其對藻細胞抑制作用的減弱.

2.3 S. ruber S2-4-1H菌液對東海原甲藻的溶藻活性

由于大部分已報道的靈菌紅素都具有光解性質[8-9]，且其提取需要額外成本，因此嘗試探究在用于赤潮防治時，產靈菌紅素菌株本身是否同樣有效.如此可降低成本，且菌株在環境中可更為持久的分泌靈菌紅素用于抑藻.將S.ruberS2-4-1H菌液以不同體積比添加至東海原甲藻培養體系中，結果見圖3，與對照組相比，1%、2%、5%菌液條件下藻細胞密度均明顯降低(圖3(a));72 h時，1%和5%下藻細胞密度類似(P>0.05)，均在70%以上.相應的，3種條件下的溶藻率在72 h內均呈上升趨勢(圖3(b)).

圖3 添加不同體積比的紅色鄰米草菌菌液與東海原甲藻混合培養時生代參數測定結果

光合系統參數的測定結果表明，從24 h開始，3種條件下東海原甲藻細胞的Fv/Fm均顯著下降并趨近于零(圖3(c))，并且NPQ也處于極低水平，表明在S2-4-1H菌液添加條件下，東海原甲藻細胞的光合系統遭受了很大的破壞，幾乎喪失光合作用及光保護能力.這與以往靈菌紅素導致微藻細胞光合效率下降的研究結果是一致的[10].只是在本實驗中，Fv/Fm下降的程度更高，基本為零.綜上所述，S2-4-1H菌液直接添加可顯著破壞東海原甲藻細胞的光合系統，包括光合作用系統及光保護系統，對藻細胞產生有效的抑制作用.

2.4 Z. ganghwensis KCTC12044對東海原甲藻和強壯前溝藻的溶藻活性

為排除實驗中MB對藻細胞生長的影響，制作細胞懸液以除去MB，用于Z.ganghwensisKCTC12044對東海原甲藻的溶藻實驗.將KCTC12044的細菌懸液分別以1%，5%，10%的體積比加入到對數生長期的東海原甲藻培養體系中，結果見圖4.

圖4 添加不同體積比的Zooshikella ganghwensis細菌懸液或菌液與東海原甲藻和強壯前溝藻混合培養時藻細胞密度、溶藻率及Fv/Fm的變化

結果表明，3個體積比條件下，細胞密度均明顯下降(P<0.01)，72 h時的溶藻率分別達到80.5%，85.9%和89%(圖4(a)(c)).Fv/Fm測定結果顯示，1%懸液條件下，藻細胞的Fv/Fm被明顯抑制，且12 h后呈持續下降趨勢；而5%和10%懸液條件下，Fv/Fm自懸液添加之后就已經接近于零，且在24 h后保持在零(圖4(e))，表明5%的懸液就足以使藻細胞在24 h內完全喪失光合作用能力.因此，KCTC12044細菌懸液在3種體積比條件下均可有效抑制東海原甲藻細胞的生長，使其基本喪失光合作用能力，產生良好的溶藻活性.

預實驗結果表明，KCTC12044的1%、5%及10%細菌懸液均不能有效抑制強壯前溝藻細胞的生長，且5%MB本身對強壯前溝藻細胞生長并沒有抑制作用，因此在KCTC12044對強壯前溝藻的溶藻活性實驗中，仍采用細菌菌液進行溶藻實驗.將細菌菌液分別以1%，2%，5%的體積比加入到強壯前溝藻培養體系中，并對其藻細胞密度、Fv/Fm及溶藻率進行測定，結果見圖4(b)(d)(f).結果顯示，添加菌液的處理組，藻細胞密度和Fv/Fm均明顯低于對照組；且菌液濃度越高，藻細胞密度和Fv/Fm越低，表明菌液中的靈菌紅素對藻細胞的生長和光合作用產生了明顯的抑制效果.其中，5%菌液處理組中藻細胞的Fv/Fm在48 h時就已降低至零，溶藻率已高達91.6%.72 h時，1%，2%，5%菌液條件下的溶藻率分別達到58.5%，81.7%和96.4%，表明在實驗所用3個體積比中，1%菌液處理組的抑藻效果并不理想，而2%和5%兩個體積比條件下，均取得80%以上的溶藻率，且5%條件下的溶藻效果最為理想.表明KCTC12044在較高濃度條件下對強壯前溝藻細胞具備有效的殺滅作用.

上述結果表明，同一種產靈菌紅素菌株或靈菌紅素對兩種甲藻物種的溶藻活性是不同的，其中KCTC12044細菌懸液及S1對強壯前溝藻均不具備良好的溶藻活性，但對東海原甲藻卻產生了有效的抑制作用.表明不同甲藻對靈菌紅素的耐受性是不一樣的，這與以往研究中靈菌紅素對不同甲藻具有不同的半抑制濃度和溶藻效率的研究結果是類似的，并且靈菌紅素對不同門類的藻類同樣具有不同的溶藻活性[9,15].一般來說，甲藻門物種相對其他門類的物種對靈菌紅素具有更強的耐受性.

3 結論

S2-4-1H所分泌的環庚基靈菌紅素S-1對東海原甲藻具有良好的抑制作用，10 μmol/L的S-1在48 h內對東海原甲藻的溶藻率可高達95%以上，但S-1和S-2均不能有效抑制強壯前溝藻細胞的生長.S2-4-1H菌液亦可在24 h內使東海原甲藻細胞基本喪失光合作用和光保護能力，對其生長產生有效抑制.而另一種產靈菌紅素菌株KCTC12044對東海原甲藻和強壯前溝藻均能產生有效抑制作用.其中，5%細菌懸液可在24 h使東海原甲藻細胞光合效率降至零，但對強壯前溝藻沒有有效抑制作用；而5%菌液可在72 h內對強壯前溝藻可產生95%以上的溶藻率.綜上所述，不同產靈菌紅素菌株及不同類型靈菌紅素對兩種甲藻細胞的溶藻活性不同，東海原甲藻和強壯前溝藻對同一種產靈菌紅素菌株或者靈菌紅素的耐受性也有所不同，其中適宜濃度的S.ruberS2-4-1H和Z.ganghwensisKCTC12044及環庚基靈菌紅素S-1對東海原甲藻均具有良好的溶藻活性，為其用于東海原甲藻赤潮防治提供了理論依據.