兔病毒性出血癥疫苗及免疫預防

文│吳宣（四川省動物疫病預防控制中心）

兔病毒性出血癥又稱兔瘟，是由兔出血癥病毒（RHDV）引起的兔的一種急性高度接觸性傳染病，以呼吸系統出血、實質性器官出血水腫變化為特征，該病傳播快、發病急、潛伏期短，感染后2～3天迅速死亡，死亡率極高（90%～100%）。當前國內預防兔病毒性出血癥常用的滅活疫苗有：兔瘟單苗、兔-巴二聯苗、兔-巴-魏（波）三聯苗。隨著分子生物學的發展，基因工程苗的研究也有了很大的進展。

一、組織滅活疫苗

組織滅活疫苗制備原理是兔病毒性出血癥病毒加入0.5%甲醛溶液制成的懸液在37℃下失去致病性而保持其免疫原性。制備過程是將兔瘟病毒接種健康兔，收取24～72小時死亡兔的含毒組織（肝、脾、腎），用緩沖液搗碎過濾后，經0.5%甲醛溶液37℃滅活24小時而制成。用該苗接種后，兔6～10天產生抗兔病毒性出血癥病毒的抗體，12～16天抗體效價達到峰值，隨后開始下降。在疫苗生產中，免疫佐劑起著重要的作用，加了佐劑的組織滅活苗克服了抗體峰值和抗體持續時間短的問題。隨著動物免疫佐劑的研究，出現了多種免疫佐劑，比如黃芪多糖、鋁膠、蜂膠、弗氏佐劑等，加入佐劑的滅活疫苗可以提高兔病毒性出血癥病毒抗原的免疫原性，刺激機體迅速產生抗體，并促使免疫系統內相關免疫細胞的活化，使抗體效價維持天數增長。經過研究發現，黃芪多糖作為中藥，具有消炎、殺菌、增強免疫力的作用，加入黃芪多糖佐劑的疫苗，抗體效價維持最長。

組織滅活疫苗在生產上一直具有良好的免疫效果，在規模場中被廣泛使用。一般在30～35日齡首免，60～65日齡二免，后備兔及母兔每隔3～5個月加強免疫，春秋發病高峰還要補充免疫。規模場對兔群不斷地加強免疫增加了養殖成本，加上易感兔和非免疫兔的日益減少，疫苗生產成本和養殖戶的養殖成本不斷增加。加上生產不穩定，制作工藝煩瑣，生產過程中散毒風險的存在，兔群機體還有一定的組織過敏反應。這些因素都導致滅活苗的發展受到限制，目前學者們主要著眼于RHDV疫苗基因工程疫苗的研究。

二、瘟巴二聯苗

將兔瘟強毒株接種健康兔，采取含毒組織（肝、脾、腎），搗碎過濾滅活后，制成滅活液。將標準兔多殺性巴氏桿菌菌株純化后在馬丁肉湯中含氧培養，純檢后備用。然后按照比例加上氫氧化鋁膠、蜂膠等佐劑配制成二聯苗。制備過程中優化生產工藝、提純病毒、提高抗原含量，兩種抗原之間無互相干擾，產生的兩種抗體滴度均達到最高。該疫苗產生抗體快，5～7天產生堅強的免疫效果；免疫期長，免疫期達6個月；兔瘟保護率95%，巴氏桿菌病保護率80%；12℃保存有效期達10月以上。

三、 兔瘟-巴氏桿菌病-魏氏梭菌三聯滅活疫苗

將兔瘟病毒皮下接種健康兔，采取瀕死或者死亡兔的肝、脾、腎等含毒組織，將組織搗碎后按比例加鹽水研磨過濾，加入甲醛混勻滅活。將巴氏桿菌接種含有裂解血的馬丁肉湯中培養24小時，純凈性檢合格后再將菌種接種于血液馬丁肉湯中含氧培養，菌液涂片檢查純度合格后按一定含菌量加入甲醛滅活。將魏氏梭菌接種到肉肝胃酶消化湯中，純檢合格后再接種到新的肉肝胃酶消化湯中培養。將合格菌液加入甲醛溶液滅活。將三種合格的滅活毒（菌）液調pH值到7.0，然后按照比例加上氫氧化鋁膠、蜂膠等佐劑配制成兔瘟-巴氏桿菌病-魏氏梭菌三聯滅活疫苗，經無菌、安全、效力實驗和物理性狀檢驗合格后備用。

二聯苗、三聯苗的對兔瘟的防治有重要作用，效果明顯、易保存，運輸方便，可在生產上也出現過注射聯苗后在免疫期內仍發生兔瘟流行，而且也存在滅活不完全引起的風險，加上如何平衡兔瘟和巴氏桿菌病、魏氏梭菌病的免疫期差距和配制比例，以增強免疫力、延長免疫期、降低成本也是值得進一步研究的問題。市場上很多聯苗因為各抗原比例、濃度等問題，在生產上使用的劑量很大，副作用很明顯，免疫效果也受到影響。

四、 基因工程疫苗

1.基因工程亞單位疫苗。VP60是RHDV的主要結構蛋白，有兩個主要的抗原決定簇，具有很高的抗原免疫性，是誘導抗病毒感染的主要核衣殼蛋白，也是分析病毒屬性和親緣關系的蛋白。通過基因工程技術將RHDV的VP60蛋白在表達載體（昆蟲細胞或者幼蟲、大腸桿菌、乳酸桿菌、腺病毒、酵母、轉基因馬鈴薯）中進行體外表達，所表達的蛋白自我裝配成與RHDV大小和形態相似的病毒樣顆粒（VLPs），該病毒顆粒不含病毒核酸，無法復制和擴增，無感染性，但具有免疫原性，可激活固有免疫應答。Boga J A等就VP60在大腸桿菌中表達，表達蛋白加入弗氏佐劑免疫兔群，能夠對兔產生保護作用。王永山等將VP60基因在大腸桿菌中表達，用重組蛋白、免疫佐劑和卡介苗素制備的亞單位疫苗，該疫苗能保護兔抵抗2倍常規攻毒劑量強毒的攻擊。Nagesha H S等用桿狀病毒-昆蟲細胞系統表達了VP60，表達蛋白可裝配成類病毒樣粒子（VLPs），病毒樣粒子可刺激兔群機體產生強烈的體液免疫，抵抗RHDV的攻擊。Xuexing Zheng等用重組桿狀病毒在蠶的幼蟲中表達VP60蛋白，加入弗氏佐劑乳化后，免疫兔群，免疫保護期可達一年；沒有加佐劑的保護期僅有180天。Boga J A等將VP60的編碼序列插入酵母表達，重組的VP60蛋白抗原在不加佐劑條件下可對RHDV完全保護。嚴維魏等將VP60基因插入酵母轉移載體中獲得重組酵母菌，該酵母菌具有良好的抗原性，且血凝性可被抗RHDV的高免血清所抑制。李傳山等構建了植物表達載體pBI21-VP60，利用根瘤農桿菌介導葉盤法轉化串葉松香草篩選擬轉基因植株，生產RHDV食用疫苗。Castanon S等構建了植物表達載體PK2-VP60表達蛋白，加入弗氏佐劑皮下注射成年兔，對照兔40小時后死亡，有明顯的臨床癥狀，而免疫兔全部存活。

VLPs具有較好的免疫原性和更好的安全性，易被免疫系統識別。用VLPs制備的疫苗低劑量免疫后就能刺激機體產生良好的免疫應答，免疫兔后即可產生較強的體液免疫應答，保護性抗體可維持1年以上。VLPs作為VP60的亞單位表達蛋白，具有很高的免疫原性，且穩定性好、安全性高，疫苗產量不受免疫兔數量的限制，可大規模生產。江蘇省農業科學院兔病學科團隊研發的兔病毒性出血癥桿狀病毒載體滅活疫苗（BACVP60株）獲得國家新獸藥一類注冊證書，這是我國第一個兔用基因工程疫苗，也是世界上第一個獲得政府許可證的兔瘟亞單位疫苗。該疫苗對家兔保護率為100%，免疫有效期達7個月，保存期長達24個月。

2.重組病毒活載體疫苗。隨著分子生物學的研究進展，VP60蛋白可在大腸桿菌、酵母和昆蟲細胞等表達系統表達，制備成亞單位疫苗，也可用馬鈴薯病毒（PPV）、串葉松香草、百脈根等植物表達為載體的重組PPV-NK-VP60蛋白，利用植物進行口服免疫，對預防RHDV是一個全新的思路。Bertagnoli S等用牛痘病毒為載體構建的重組病毒經皮內和口服免疫兔，可抵抗RHDV強毒的攻擊，對野兔的RHD也有很好的免疫作用。Erlinda Fernundeza等用腺病毒載體構建了表達VP60蛋白的重組載體制備疫苗，產生的抗體可保持1年以上。此外還有很多學者用鳥痘病毒、兔痘病毒、金絲雀痘病毒等為基礎的載體構建的重組病毒活載體疫苗，可產生滴度很高的抗RHDV特異性抗體，抵抗RHDV強毒的攻擊。重組疫苗對妊娠母兔和其繁殖率無任何的副作用，具有良好的生物安全性和穩定性。Torres等用100倍的試驗劑量對重組病毒疫苗使用的安全性做了評估，未引起家兔的免疫耐受，對孕兔也未造成傷害。

Barcena J等用減毒的黏液瘤病毒（MV）構建表達出的VP60免疫兔，可同時保護MV和RHDV和攻擊，因為表達的重組病毒帶有可轉移的胃腸炎病毒（TGEV）的抗原決定簇。Juan Barcena等用MV的一株自然弱毒株構建了重組RHDV活載體疫苗，也可阻止兩種疾病的發生。Bertagnoli S等用MV的一株細胞致弱毒株構建了重組MV-RHDV，可誘導高水平的RHDV和MV特異性抗體，可抵抗致死量RHDV和MV的攻擊。用兔黏液瘤病毒作為RHDV的載體，可同時有效預防兔群的兩大疾病，有效地降低了重組疫苗向非目標宿主散播的風險。致弱的兔黏液瘤病毒，既不會向自然界引入新病毒的危險，也可保證病毒的水平傳播特性。黃艷秋等用牛皰疹病毒1型為載體，制備了RHDV VP60重組蛋白疫苗，該疫苗可誘導小鼠產生RHDV特異性抗體。

兔病毒性出血癥基因工程疫苗的研制及在臨床中的成功應用，為我國養兔業在兔瘟防控領域找到新的方向，但是不同載體表達產物作為基因工程疫苗仍具有不同的缺陷。比如大腸桿菌表達的VP60具有不可溶性及免疫效果相對較差；重組痘病毒載體疫苗引起兔全身潛伏感染；重組病毒疫苗存在向環境擴散的安全問題；轉基因植物載體的表達量不理想等，加上新的變異亞型的出現，傳統的兔病毒性出血癥疫苗無法對其保護。但是Nadya Urakova（30）等研究發現RHDV在小鼠體內的能力較差，用高劑量的RHDV攻擊標準的實驗室小鼠和缺乏功能性I型干擾素受體的基因敲除動物，這些動物都沒有出現疾病的臨床跡象，通過實時聚合酶鏈式反應PCR對病毒RNA的時間定量也并沒有顯示出病毒擴增的跡象。這些數據表明RHDV不能在小鼠體內復制，甚至不能在先天免疫系統嚴重受損的動物體內復制。這就需要科研人員加快對基因工程疫苗的研發，使其發揮優良高效的免疫保護作用，以保障養兔業的健康發展。