香葉木素對嗜水氣單胞菌氣溶素表達的抑制作用

李聲平，馬亮，閆天慧，艾曉輝，董靖

中國水產科學研究院長江水產研究所，武漢 430223

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）是一種宿主廣泛的條件性致病菌，可在人和動物，尤其是水生動物中引起多種疾病[1］，如斑點叉尾鮰的套腸病[2］、鱉白點病和白底板病[3］、鯉出血病[4］等，均會造成養殖業的重大經濟損失[5］。在水產養殖中，嗜水氣單胞菌感染主要依賴化學抗菌藥物進行防控，而藥物的不規范使用導致菌株出現耐藥性[6］。此外，藥物在魚體內的蓄積和殘留，會對食用的人群產生安全隱患[7］。近年來，依據干預細菌感染過程的思路，誕生了多種抗菌藥物研發的新策略，其中抗毒力策略可作為抗嗜水氣單胞菌感染藥物研發的新途徑[8］。

嗜水氣單胞菌能分泌氣溶素、溶血素和腸毒素等多種毒力因子，其致病力與這些毒力因子密切相關[9］。氣溶素是嗜水氣單胞菌的主要毒力因子之一，可以引起紅細胞發生溶血現象，對細胞也有毒性作用，可作為鑒別致病菌株的重要標志[10］。有研究發現，氣溶素基因缺失型嗜水氣單胞菌的致病性顯著低于野生型菌株[11］。因此，氣溶素可作為抗嗜水氣單胞菌感染藥物研發的新靶標。

香葉木素主要存在于菊花、薄荷等中草藥以及柑橘類水果中，具有抗菌、抗炎、抗氧化和抗腫瘤等藥理學活性[12］。目前香葉木素對嗜水氣單胞菌致病力的影響鮮有報道。本研究通過最小抑菌濃度測定、生長曲線、溶血試驗、免疫印跡和熒光定量PCR等試驗分析了香葉木素抑制嗜水氣單胞菌氣溶素表達的機制，通過活/死細胞染色研究了香葉木素對嗜水氣單胞菌氣溶素介導的細胞毒性的保護作用，旨在為以毒力因子為靶標的抗嗜水氣單胞菌感染藥物研發提供新的思路和候選化合物。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

香葉木素（純度≥98%）購自四川維克奇生物科技有限公司；嗜水氣單胞菌XS-91-4-1 由中國科學院水生生物研究所李愛華研究員贈送；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG購自鼎國生物公司；兔抗氣溶素多克隆抗體由筆者所在實驗室制備；活/死細胞雙染色試劑盒購自翌圣生物公司。香葉木素用DMSO制備成40.96 mg/mL母液，備用。

1.2 最小抑菌濃度(MICs)測定

采用肉湯微量稀釋法在96孔板中測定香葉木素和恩諾沙星對嗜水氣單胞菌XS-91-4-1 的MICs[13］，挑取XS-91-4-1 單菌落至LB 液體培養基培養過夜（28 ℃），180 r/min 離心收集菌體，用無菌PBS 洗滌3 次后重懸至濃度約為1.5×108CFU/mL。在96孔板中將藥物倍比稀釋，使香葉木素和恩諾沙星的質量濃度范圍分別為512~1 μg/mL 和64~0.125 μg/mL，每孔中藥物體積為100 μL；向每孔中加入稀釋好的菌液100 μL，使其終濃度為5×105CFU/mL。分別設置陽性和陰性對照組，陽性對照組只加菌不加藥，陰性對照組只加新鮮LB培養基。將96孔板置于恒溫培養箱中，28 ℃靜置培養過夜，以細菌未生長的最小藥物濃度定為藥物的MIC。

1.3 生長曲線測定

將過夜的XS-91-4-1 菌液按1%接種于新鮮LB液體培養基中，28 ℃振蕩培養至OD600nm=0.3，分裝于50 mL 錐形瓶中，加入不同質量濃度的香葉木素，使藥物終質量濃度分別為4、8、16、32 μg/mL。只加DMSO 組作為無藥物處理組。在28 ℃繼續培養5 h，每0.5 h測1次OD600nm的吸光值。

1.4 溶血試驗

將菌株XS-91-4-1 接種于LB 液體培養基中，28 ℃振蕩培養至OD600nm=0.3，并分裝于50 mL錐形瓶中。向每瓶中加入香葉木素，使菌液中香葉木素的終質量濃度為0、4、8、16、32 μg/mL。在28 ℃搖至OD600nm=1.5 時，高速離心（13 300 r/min，1 min）收集上清液凍存備用。將上清液中加入胰蛋白酶（20 μg/mL）激活氣溶素，用于溶血和免疫印記試驗[14］。溶血試驗反應體系如下：875 μL 的溶血緩沖液，100 μL 已激活的上清液，5×106個脫纖維綿羊紅細胞（25 μL）。反應體系充分混勻后置于37 ℃培養箱中孵育15 min。反應結束后以13 300 r/min 離心1 min，取上清液測定OD543nm的吸光值。以不加藥物上清液為100%溶血對照，試驗組測得吸光度與陽性對照組的比值為溶血百分比。

1.5 免疫印跡試驗

將本文材料與方法“1.4”中胰蛋白酶處理的菌液上清用于蛋白免疫印跡試驗。上清液經樣品制備后進行SDS-PAGE 電泳分離目標蛋白，然后通過濕法將蛋白轉印至PVDF 膜上；用5%脫脂奶粉將PVDF膜封閉2 h；兔抗氣溶素多克隆抗體（1∶1 000）室溫孵育1 h；TBST 洗滌3 次后用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（1∶4 000）孵育1 h；TBST 洗滌3 次；加入ECL 發光液避光孵育3 min 后，用凝膠成像系統進行化學發光觀察并拍照。

1.6 熒光定量PCR

菌株培養方法同本文材料與方法“1.4”。菌株XS-91-4-1 與不同質量濃度的香葉木素在28 ℃振蕩培養至OD600nm=1.5 時，13 300 r/min 離心1 min 保留菌體用于提取細菌總RNA。將總RNA 加入到反轉錄試劑中合成cDNA 并用于后續的熒光定量PCR反應，每個濃度試驗組重復3 次。熒光定量PCR 試驗所用到的引物序列見表1，16S rRNA 為內參基因。試驗數據用2?ΔΔCt法進行分析，計算不同質量濃度香葉木素處理后aerA基因的相對表達量。

表1 試驗中使用的引物Table 1 Primer pairs used in test

1.7 細胞毒性試驗

將人非小細胞肺癌細胞（A549）接種至含有10%的胎牛血清和1%雙抗的DMEM 培養基的細胞培養瓶中，37 ℃含5%CO2培養箱中傳代培養。當細胞長滿瓶底80%時，棄去舊培養基，用無菌PBS 洗3 次后，加胰蛋白酶消化3~5 min 后重懸細胞。向96 孔板中加入細胞，使其終濃度為2.5×105個/孔，繼續培養16~18 h 使細胞完全貼壁。按本文材料與方法“1.4”收集菌液上清，經0.22 μm 濾膜過濾除菌后加入到每孔中。菌液上清與細胞共孵育2 h 后棄去上清液，用無菌PBS洗滌3次，加入活/死細胞雙染色試劑反應30 min后用熒光顯微鏡拍攝圖像。

2 結果與分析

2.1 香葉木素對嗜水氣單胞菌生長的作用

根據MICs試驗可知，香葉木素和恩諾沙星對嗜水氣單胞菌XS-91-4-1的MIC分別為512和4 μg/mL，通過添加DMSO 到陽性對照組發現DMSO 對細菌生長沒有影響。此外，通過生長曲線試驗發現，4~32 μg/mL 的香葉木素與嗜水氣單胞菌共培養不影響嗜水氣單胞菌的生長（圖1）。綜上，香葉木素在本研究的試驗條件下對嗜水氣單胞菌的生長沒有抑制作用，幾乎不會對嗜水氣單胞菌造成選擇性壓力。

圖1 嗜水氣單胞菌與香葉木素共培養的生長曲線Fig.1 Growth curves of A.hydrophila co-cultured with diosmetin

2.2 香葉木素對嗜水氣單胞菌上清液溶血活性的抑制作用

由圖2可知，香葉木素可劑量依賴性地降低嗜水氣單胞菌上清液的溶血活性；當香葉木素質量濃度分別為4、8、16和32 μg/mL 時，其上清液溶血量分別為63.20%、48.62%、41.96%和24.46%。當香葉木素質量濃度在4 μg/mL 及以上時，能顯著抑制上清液中溶血活性。該結果提示，香葉木素可能通過抑制氣溶素的表達或活性發揮作用。

圖2 香葉木素對嗜水氣單胞菌上清液溶血的抑制作用Fig.2 Impact of diosmetin on hemolytic activity of bacterial supernatants

2.3 香葉木素對氣溶素表達的影響

蛋白免疫印跡試驗結果如圖3所示，隨著香葉木素質量濃度的增加，嗜水氣單胞菌上清液中氣溶素的含量逐漸下降，當香葉木素質量濃度達到32 μg/mL時，上清液中幾乎檢測不到氣溶素。該結果表明，香葉木素與嗜水氣單胞菌共培養后可劑量依賴性地降低氣溶素的表達。

圖3 不同質量濃度香葉木素處理后培養物上清液中氣溶素的含量Fig.3 Amount of aerolysin in bacterial supernatants after a co-incubation with diosmetin at different concentrations

2.4 香葉木素對aerA基因轉錄的抑制作用

熒光定量PCR 試驗結果如圖4 所示，與未加藥物組相比，香葉木素處理組氣溶素編碼基因aerA的轉錄水平呈劑量依賴性降低。當香葉木素質量濃度分別為4、8、16 和32 μg/mL 時，aerA的轉錄水平分別下調至無藥物處理組的50.42%、26.33%、11.94%和11.04%。與未加藥對照組相比，8 μg/mL 及以上香葉木素處理的嗜水氣單胞菌，其aerA的轉錄顯著下降。

圖4 香葉木素處理后嗜水氣單胞菌aerA基因的轉錄水平Fig.4 Transcription levels of aerA genes in A.hydrophila treated with diosmetin

2.5 香葉木素對氣溶素介導的細胞損傷的保護作用

如圖5A 所示，未經處理的細胞為活細胞，被染成綠色；而無藥物上清處理的細胞出現了大量死亡，被染成紅色（圖5B）；與無藥上清處理組相比，含有32 μg/mL 香葉木素的上清液與細胞共培養后，死亡細胞減少（圖5C），與未處理組相當。該結果表明，香葉木素可減少氣溶素介導的細胞損傷。

圖5 香葉木素對氣溶素介導的細胞損傷的保護作用Fig.5 Protective effect of diosmetin against aerolysin mediated cell injury

3 討 論

香葉木素是一種天然黃酮類化合物，具有抗氧化、抗腫瘤和抗炎抑菌作用[15］。Meng 等[16］從皺葉絹毛苣中分離到了香葉木素，并研究了其對常見細菌的最小抑菌濃度，結果發現香葉木素對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉菌的MIC分別為50、50、100 和50 μg/mL，而對白色念珠菌和紅色毛蘚菌的MIC 大于100 μg/mL。Li等[17］通過研究發現香葉木素能改變小鼠腸道菌群結構，從而提高其腸道的功能。Gomez-chang 等[18］研究發現香葉木素在低至3.9 μg/mL 時，即可抑制91.94%的幽門螺桿菌的生長。目前香葉木素抑制水產源病原菌的研究較少，馬亮等[19］發現香葉木素可抑制克氏原螯蝦源普通變形桿菌的生長，其MIC 為256 μg/mL。本研究發現香葉木素在質量濃度高達512 μg/mL 時才能抑制嗜水氣單胞菌生長，提示其幾乎沒有抑制嗜水氣單胞菌生長的作用。此外，通過生長曲線發現，香葉木素質量濃度為32 μg/mL 及以下時，對嗜水氣單胞菌的生長無影響。

Chan 等[20］發現香葉木素能通過抑制金黃色葡萄球菌的丙酮酸激酶的活性，導致其ATP缺乏，從而提高其抗菌作用。而我們通過溶血試驗發現，香葉木素能降低嗜水氣單胞菌上清液的溶血活性，從而降低嗜水氣單胞菌的毒力。且相比于Sun 等[21］研究的七葉苷在25 μg/mL 時能顯著減少嗜水氣單胞菌上清液的溶血活性，香葉木素在4 μg/mL 時也能達到同樣效果，提示香葉木素的試驗效果要優于七葉苷。本研究進一步通過Western-blot 試驗和熒光定量PCR 試驗，驗證了香葉木素對嗜水氣單胞菌氣溶素的抑制效果。這與Dong 等[22］研究的百里香酚能夠抑制嗜水氣單胞菌溶血活性和氣溶素表達，具有類似的效果，但百里香酚的機制是通過抑制嗜水氣單胞菌的群體感應從而降低氣溶素的表達和生物被膜形成，香葉木素僅抑制aerA的轉錄，對群體感應的相關基因的表達并沒有影響。Liu等[23］研究發現，香葉木素能在亞抑制濃度下抑制金黃色葡萄球菌的α-溶血素的表達，從而降低α-溶血素對A549 細胞的損傷。而本試驗也發現香葉木素對氣溶素介導的A549細胞損傷也具有明顯的保護效果。以上發現提示，香葉木素可作為治療嗜水氣單胞菌感染的潛在藥物。