miR-203a-3p通過ALOX15途徑抑制胃癌細胞鐵死亡

唐鳳英， 董汾， 曾玉婷， 高二鵬， 張鋒利， 閆娣

(陜西中醫藥大學第二附屬醫院消化內科，陜西省咸陽市712000)

胃癌是中國第二大常見癌癥，也是癌癥死亡的第二大原因[1]，盡管化療和靶向治療胃癌(曲妥珠單抗)獲得了部分臨床效果，但仍然面臨著腫瘤侵襲和轉移的問題。鐵死亡是一種鐵依賴性細胞壞死類型，生理條件下多不飽和脂肪酸經常被脂肪氧化酶氧化，但會立即被谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)及其輔因子谷胱甘肽還原[2]，然而，當還原功能障礙時脂質過氧化物會在細胞中積累，誘導細胞還原性鐵離子被氧化而導致細胞死亡，這稱為鐵死亡[3]。研究發現，miR-203a-3p和ALOX15參與了胃癌細胞的鐵死亡過程，而癌細胞對鐵死亡的敏感性與癌癥的治療效果相關[4]，但目前尚無證據表明miR-203a-3p和ALOX15是相互作用從而調控胃癌細胞鐵死亡，本文對miR-203a-3p通過ALOX15途徑調控胃癌細胞鐵死亡的機制進行了研究，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 組織取材、主要試劑和儀器

選取2020年1月—2021年1月本院15例胃癌患者術后的胃癌組織和癌旁正常組織，本研究獲得本院倫理委員會批準，所有患者均知情同意。線粒體熒光探針(TMRE)購自上海麥克林生化科技有限公司。7-氨基放線霉素D購自YEASEN公司。miRNA模擬物(miRNA mimics)、miRNA抑制劑(miRNA inhibitor)、小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)和過表達質粒均由南京金斯瑞設計和合成。ALOX15抗體購自廣州佰匯生物科技有限公司。雙熒光素酶報告試劑盒購自諾唯贊公司。酶標儀(318C)購自天美儀拓實驗室設備(上海)有限公司?；瘜W發光儀(LAS500)購自Cytiva(思拓凡)公司。實時熒光定量PCR儀購自北京托摩根生物科技有限公司。流式細胞儀(NovoCyte)購自安捷倫科技(中國)有限公司。

1.2 細胞培養和處理

人胃正常細胞GES-1購自深圳震科生物科技有限公司。人胃正常細胞RGM-1購自北京綠源伯德生物科技有限公司。人胃癌細胞株SGC7901、MGC803、MKN45購自PROCELL公司。所有細胞株在DMEM培養基(含10%胎牛血清及1%雙抗)37 ℃、5%CO2培養。使用前對每個細胞系進行支原體污染檢測。將Lipo3000轉染試劑、不同質粒、細胞培養基混合，加入細胞轉染12 h后換成正常的培養基。

1.3 免疫印跡法檢測ALOX15蛋白水平

從轉染的細胞中提取蛋白質，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，然后將其轉移到聚偏二氟乙烯膜，用5%牛血清蛋白封閉2 h，將膜與一抗4 ℃下孵育過夜。之后，將膜用PBS緩沖液洗滌3次，每次10 min。使用相應HRP標記的二抗將膜在室溫下孵育2 h，用PBS緩沖液洗滌3次，通過電化學發光劑檢測系統檢測ALOX15和GAPDH的蛋白表達水平。

1.4 實時熒光定量PCR檢測miR-203a-3p表達水平

使用TRIzol試劑提取細胞mRNA，將mRNA反轉錄為cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq進行實時熒光定量PCR，U6小核RNA(U6 small nuclear RNA，U6)和GAPDH分別為miRNA和mRNA內參。引物序列miR-203a-3p正：5′-CGGCGTGAAATGTTTAGG-3′，反：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6正：5′-CTCGCT TCGGCAGCACATAT-3′，反：5′-TTGCGTGTCATCCTTGCG-3；ALOX-15正：5′-ACTGAAATCGGGCTGCAA GGG-3′，反：5′-GGGTGATGGGGGCTGAAATAA-3′；GAPDH正：5′-CCATCACCATCTTCCAGGAGCGA-3′，反：5′-GGATGACCTTGCCCACAGCCTTG-3′。

1.5 RNA高通量測序檢測胃癌組織miRNA表達譜

采用TRIzol法提取RNA。NEBNext超定向RNA文庫制備試劑盒用于制備鏈特異性RNA-seq文庫。50 ng核糖體去除的RNA樣品片段化，使用隨機六聚體引物合成第一鏈和第二鏈互補DNA(cDNA)。cDNA進行13～15個循環PCR擴增，用Bioanalysisr 2100進行文庫分析，然后在HiSeq 2000系統中對cDNA進行測序。

1.6 熒光素酶報告基因分析

合成野生型和突變型ALOX15片段，并將其插入到pMIR-REPORT質粒的熒光素酶報告基因下游(MT-ALOX15 3′UTR和WT-ALOX15 3′UTR)。使用Lipo3000轉染試劑將miR-203a-3p mimics與報告基因共轉染到SGC7901細胞中。采用雙熒光素酶報告試劑盒檢測螢火蟲和海腎熒光素酶活性。序列miR-203a-3p mimic正：5′-GUGAAAUGUUUAGGACC ACUAG-3′，反：5′-CACUUUACAAAUCCUGGUGAUC-3′；miR-203a-3p inhibitor正5′-CUAGUGGUCCUAAACAUU UCAC-3′，反：5′-GCTCTATTGTGTACTATGA-3′。

1.7 7-氨基放線霉素D法檢測lipid-ROS

將細胞接種于6孔板，用含10 μmol/L C24H16Cl2O7無血清培養基培養30 min。收集細胞并用無血清培養基洗滌3次，在無血清培養基中重懸，用5 μL 7-氨基放線霉素D黑暗孵育5 min。采用酶標儀檢測熒光強度，激發波長488 nm，發射波長525 nm。lipid-ROS=樣品熒光強度-空白孔熒光強度。

1.8 流式細胞儀測定線粒體膜電位

細胞接種于6孔板中，加入終濃度0.5 mmol/L TMRE孵育30 min。用PBS清洗細胞去除多余TMRE。收集并重懸標記的細胞，用流式細胞儀分析Ex/Em=549/575 nm處熒光。線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)=處理過細胞熒光強度/陰性對照熒光強度。處理過的細胞為過表達miR-203a-3p或對照胃癌細胞樣品。陰性對照為僅用鐵死亡誘導劑Erastin處理后的細胞樣品。

1.9 統計學分析

2 結 果

2.1 胃癌組織或細胞miR-203a-3p與鐵死亡具有相關性

miR-203a-3p水平胃癌組織高于癌旁正常組織,胃癌細胞株高于胃正常細胞(P<0.05；圖1)。lipid-ROS水平胃癌組織低于癌旁正常組織，胃癌細胞株低于胃正常細胞(P<0.05；圖1)。胃癌組織miRNA高通量測序miR-203a-3p水平與lipid-ROS水平呈負相關(r=-6.194，P<0.05)。以上提示，胃癌miR-203a-3p與鐵死亡具有相關性。

圖1 胃癌組織或細胞miR-203a-3p與鐵死亡具有相關性

2.2 miR-203a-3p抑制胃癌細胞鐵死亡

過表達miR-203a-3p后，胃正常細胞lipid-ROS水平降低；敲低miR-203a-3p后，胃癌細胞株lipid-ROS水平升高(P<0.05；圖2)。鐵死亡誘導劑Erastin處理后，過表達miR-203a-3p使胃癌細胞株MMP水平降低(P<0.05；圖2)。以上提示，miR-203a-3p抑制胃癌細胞鐵死亡。

圖2 miR-203a-3p抑制胃癌細胞鐵死亡

2.3 miR-203a-3p靶向ALOX15調控胃癌細胞鐵死亡

mRNA高通量測序發現有59個基因同時滿足以下條件：①過表達miR-203a-3p時降低；②敲低miR-203a-3p時升高。篩選上述基因在鐵死亡中的功能，發現敲低ALOX15時胃正常細胞lipid-ROS和MMP降低，過表達ALOX15后胃癌細胞株lipid-ROS水平升高(P<0.05)。胃癌組織ALOX15 mRNA水平低于癌旁正常組織(P<0.05)。過表達miR-203a-3p后，ALOX15 mRNA和蛋白水平降低；敲低miR-203a-3p后，ALOX15 mRNA和蛋白水平升高(P<0.05；圖3)。以上提示，miR-203a-3p靶向ALOX15調控胃癌細胞鐵死亡。

圖3 miR-203a-3p靶向ALOX15調控胃癌細胞鐵死亡

2.4 miR-203a-3p和ALOX15結合位點分析

圖4顯示，miR-203a-3p能特異性與ALOX15結合(圖4)。

圖4 miR-203a-3p與ALOX15的結合位點

3 討 論

細胞死亡受到復雜的胞內和胞外信號的嚴格調控，是包括體內平衡、發育和疾病在內的各種生物過程所必需的[5]。癌細胞增殖與死亡的不平衡是導致惡性生物學特性產生的重要原因[6]。腫瘤細胞已經顯示出復雜的代謝適應策略，以在代謝應激條件下生存并允許腫瘤發展，包括阻斷細胞程序性死亡[7]。鐵死亡是一種新型的細胞程序性死亡，涉及鐵依賴的lipid-ROS的積累[8]。最近的研究表明，鐵死亡在介導某些類型癌癥的腫瘤發展和耐藥中有重要作用，但其詳細的分子機制尚不清楚，包括胃癌[9]。本研究鑒定了胃癌細胞中鐵死亡的關鍵分子ALOX15和miR-203a-3p，為胃癌藥物研發提供了新靶標。

本研究發現，過表達miR-203a-3p后，胃正常細胞lipid-ROS降低、胃癌細胞MMP水平降低。敲低miR-203a-3p后，胃癌細胞株lipid-ROS水平升高。有研究發現，miR-203a-3p可通過調控PI3K/Akt通路促進肝細胞增殖[10]。最近研究發現，miR-203a-3p可通過靶向PDE4D促進結直腸癌的增殖和遷移[11]。但是，這些研究并未將miR-203a-3p與鐵死亡進行關聯，而是將miR-203a-3p的生物學功能聚焦于細胞凋亡上。本研究發現，miR-203a-3p能夠抑制胃癌細胞鐵死亡。此外，miR-203a-3p可能是多種腫瘤的促進因子，其在其他腫瘤中的生物學功能是否與鐵死亡相關值得進一步探討。

miRNAs是一類長度為21～25個核苷酸的內源性微小調控RNA，與mRNA的3′-非編碼區(UTR)結合，可廣泛調控基因表達[12]，這種與特定序列的不完美堿基配對可導致相應mRNA的降解或翻譯抑制[13]。已有研究報道，許多miRNAs通過多種途徑在調節癌細胞增殖、分化、凋亡、遷移和侵襲等方面發揮重要作用[14]，在胃癌細胞中miR-203a-3p靶向降解了ALOX15 mRNA，減少了ALOX15的蛋白水平，并通過ALOX15調控胃癌細胞的生命進程。在本研究中，過表達miR-203a-3p后，ALOX15 mRNA和蛋白水平降低；敲低miR-203a-3p后，ALOX15 mRNA和蛋白水平升高。同時，miR-203a-3p靶向ALOX15 mRNA發揮作用。

ALOX15是花生四烯酸脂氧合酶家族成員之一[15]?；ㄉ南┧嶂鹾厦讣易灞徽J為是脂質過氧化產生的關鍵介質，并最終導致鐵死亡[16]。此外，GPX4對半胱氨酸攝入的抑制和失活都會導致過度的脂質過氧化，從而導致細胞死亡[17]。因此，lipid-ROS在癌細胞中保持動態平衡可避免鐵死亡。以前的研究集中在GPX4作為治療靶點的潛在用途，但如何抑制ALOX15表達的機制仍知之甚少。在本研究中，敲低ALOX15時胃正常細胞lipid-ROS降低和胃癌細胞MMP水平降低。過表達ALOX15后胃癌細胞株lipid-ROS水平升高。此外，胃癌組織ALOX15 mRNA水平低于癌旁正常組織。因此，本研究解釋了ALOX15表達減少的原因，為胃癌治療靶點的選擇提供了新思路。

綜上所述，ALOX15可以促進胃癌細胞發生鐵死亡。胃癌中高表達的miR-203a-3p可靶向ALOX15 mRNA的3′端非編碼區，減少ALOX15的蛋白表達水平，抑制了鐵死亡的發生。