GLI4在結腸癌中的表達及對癌細胞生物學行為的影響

薛小春， 陸翠華， 田堯

(1.南通大學醫學院，江蘇省南通市226001；2.南通大學附屬醫院消化內科，江蘇省南通市226001；3.海安市人民醫院，江蘇省海安市226600)

結腸癌是常見的發生于結腸部位的消化道惡性腫瘤，對結腸癌分子機制研究的不斷進展將有助于尋找新的治療方法。膠質瘤相關癌基因蛋白(glioma associated oncogene proteins,GLI)是C2H2-Kruppel型轉錄因子[1]，特定同源物和細胞環境存在4種GLI蛋白(GLI1、GLI2、GLI3和GLI4)，可作為基因表達激活劑或阻遏物[2]。GLI介導的轉錄調控與GLI蛋白作為Hedgehog(HH)信號通路的下游效應器所發揮的作用有關，也稱為HH/GLI信號通路[3]。GLI1通過HH的非典型上調和/或激活是多種癌癥的致癌驅動因素，包括結腸癌[4]。但是，同為GL1家族的GLI4在癌癥中的作用尚不明確?；诖?，本研究旨在探討GLI4在結腸癌中的表達及對癌細胞生物學行為的影響。

1 材料和方法

1.1 入選病例

納入2019年10月—2021年10月本院收治的結腸癌患者160例，其中男94例，女66例，年齡(69.15±25.07)歲。所有患者術前未接受任何治療，組織被采集后快速冷凍在液氮中，-80 ℃保存。所有患者均病理確診，并簽署知情同意書。本研究方案經本院倫理委員會批準。

1.2 試劑和儀器

GLI4哺乳動物過表達質粒和siGLI4均由南京金斯瑞設計合成。Lipofectamine 3000購自廣州瑞舒生物科技有限公司。SYBR-green IMaster Mix購自Thermo公司。N-cadherin、E-cadherin、NANOG、OCT4、GAPDH抗體購自Abcam公司。GLI4抗體購自Sigma公司。 白細胞介素-4(interleukin-4，IL-4)ELISA試劑盒購自北京冬歌博業生物科技有限公司。IL-5 ELISA試劑盒購自北京奇松生物科技有限公司。IL-6 ELISA試劑盒購自北京依珊匯通科技有限公司。IL-10 ELISA試劑盒購自安徽澤升科技有限公司。TRIzol試劑購自上海碧云天生物技術有限公司。Cell Counting Kit-8購自廣州寶匯生物科技有限公司。

1.3 細胞培養與處理

結腸癌細胞LoVo、SW1116購自Procell公司。結腸癌細胞LoVo、SW1116于37 ℃、5%CO2在含有10%胎牛血清的RPMI-1640中培養。將GLI4哺乳動物過表達質粒和siGLI4用Lipofectamine 3000轉染LoVo或SW1116細胞中48 h后進行以下實驗。

1.4 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR檢測結腸癌細胞GLI4、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 mRNA相對表達水平。轉染GLI4過表達質粒后，利用TRIzol從SW1116細胞中提取總RNA，并反轉錄cDNA。采用SYBR-green IMaster Mix進行qRT-PCR檢測。使用2-ΔΔCt計算基因表達，并通過GAPDH歸一化進行定量。GLI4-F：5′-GGAGTCAACTTCGGTCGGAG-3′，R：5′-TCAGGA GCAGCGAGTTATACT-3′；GAPDH-F：5′-TGTGGGC ATCAATGGATTTGG-3′，R：5′-ACACCATGTATTCC GGGTCAAT-3′；IL-4-F：5′-GCCAAGACCCCTTCG AGAAAT-3′，R：5′-CCGATCCTGTTATCTGCCTCC-3′；IL-5-F：5′-ATCATCGTGGCGCATGTATTAC-3′，R：5′-AAAGAACTTGAGCCAAACCAGT-3′；IL-6-F：5′-GAA GAGCGCCGCTGAGAAT-3′，R：5′-GTGCAGAGGGTTTAATGTCAACT-3′；IL-10-F：5′-TACCACCTCCCGAA AATGTCA-3′，R：5′-CCCAGTCTGAATGCTCATCTG-3′。

1.5 TCGA數據收集和分析

從TCGA(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)數據庫下載結腸癌表達譜。本研究收集87個樣本的htseq計數和每千堿基外顯子每百萬reads mapped(FPKM)的片段，檢索患者人口學信息和生存終點。利用DEseq2分析GLI4在結腸癌組織和癌旁正常組織中的表達差異。當錯誤發現率(FDR)調整P<0.05時，log(fold-change)>1.0或<-1.0分別被定義為下調或上調基因。

1.6 免疫組織化學

免疫組織化學檢測結腸癌組織和癌旁正常組織GLI4蛋白表達水平。包埋組織切片，65 ℃脫蠟4 h，放置在0.3%過氧化氫和甲醇溶液中30 min。磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌后，組織切片樣品與GLI4一抗(1∶100)4 ℃孵育過夜，室溫下生物素化二抗孵育20 min。陰性對照用另一個芯片中的稀釋緩沖液代替一抗。PBS洗滌后，DAB中孵育5 min，進行免疫染色。洗滌后，用乙醇和二甲苯脫水，用永久培養基固定，顯微鏡下觀察，根據染色深度判斷GLI4表達水平。

1.7 酶聯免疫吸附實驗

按照說明書操作，用ELISA IL-4、IL-5、IL-6和IL-10試劑盒分別測量結腸癌細胞LoVo和SW116上清中IL-4、IL-5、IL-6、IL-10含量。使用自動酶標儀ELX 808IU在450 nm處讀取光密度。使用二次曲線擬合分析結果。

1.8 細胞增殖的測定

結腸癌LoVo或SW1116細胞增殖由Cell Counting Kit-8確定。將細胞以2×103個/孔接種于96孔板，處理結腸癌細胞后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育1 h，按照說明操作，在570 nm處測量光密度。

1.9 免疫印跡

LoVo或SW1116細胞用裂解緩沖液在冰上裂解，裂解液在12 000×g條件下離心15 min。BCA試劑盒用于評估蛋白水平。蛋白經SDS-PAGE處理，轉移至PVDF膜。一抗和二抗按順序孵育膜。利用ECL檢測系統對蛋白質條帶進行可視化檢測。使用ImageJ計算蛋白質條帶的灰度值，結果以灰度值顯示。

1.10 轉錄組測序和免疫浸潤分析

利用TRIzol試劑從結腸癌組織中抽取RNA，由諾禾致源公司進行RNA轉錄組測序并分析免疫細胞分子標志物；根據測序結果中免疫細胞分子標志物的表達水平檢測GLI4表達與CD56brightNK細胞等免疫細胞浸潤的相關性。

1.11 統計學分析

2 結 果

2.1 GLI4在結腸癌的表達水平和對預后的影響

TCGA數據庫中結腸癌患者基于不同GLI4表達組的Kaplan-Meier生存分析，GLI4高表達患者的中位生存期低于低表達患者(圖1A)。在TCGA(圖1B)和本研究(圖1C)隊列中，GLI4在結腸癌組織中的表達均高于癌旁正常組織,本研究隊列中GLI4表達與淋巴結轉移和分期具有相關性(P<0.05；表1)。

圖1 GLI4在結腸癌的表達水平和對預后的影響

表1 不同表達水平GLI4與結腸癌患者臨床特征的關系(n=80) 單位：例(%)

2.2 GLI4促進結腸癌細胞增殖、上皮間充質轉化能力和干性

結腸癌細胞LoVo和SW1116增殖在過表達GLI4后上升，在敲低GLI4后下降(P<0.05；圖2)。結腸癌細胞LoVo和SW1116的E-cadherin水平在過表達GLI4后下降，在敲低GLI4后升高；N-cadherin則與E-cadherin相反；提示GLI4的敲低阻斷了上皮間充質轉化過程(P<0.05；圖2)。過表達GLI4后，結腸癌細胞LoVo和SW1116的NANGOG和OCT4在過表達GLI4后上升，在敲低GLI4后下降，提示GLI4的敲低減少了結腸癌細胞的干性(P<0.05；圖2)。

2.3 GLI4促進CD56bright NK細胞抑制因子的分泌

將免疫浸潤中的免疫細胞與GLI4表達水平進行相關性分析發現，CD56brightNK細胞數與GLI4的表達水平呈正相關(圖3A)。結腸癌細胞LoVo和SW1116中CD56brightNK細胞抑制因子IL-4、IL-5、IL-6、IL-10在過表達GLI4后上升，在敲低GLI4后下降(圖3B)。

圖3 GLI4促進CD56bright NK細胞抑制因子的分泌

3 討 論

在全球癌癥發病率和死亡率排名中，結腸癌分別位列第三位和第四位[5]，每年有超過100萬新的結腸癌病例和大約60萬人死于結腸癌[6]。結腸癌的發生和發展涉及多種因素，包括癌基因的激活和抑癌基因的失活[7]。由于抗腫瘤治療方法的改進，近幾十年來，每年的死亡人數正在逐漸減少[8]。遺傳和表觀遺傳的改變被認為與結腸癌惡化密切相關[9]。據預測，結腸癌的死亡率將在2035年前不斷攀升[10]。對結直癌分子機制的不斷探討將有助于尋找新的治療方法。

本研究通過分析TCGA數據庫發現GLI4高表達結腸癌患者的中位生存期明顯低于低表達患者。在TCGA數據庫的隊列和本研究隊列結腸癌患者中，GLI4在結腸癌組織中的表達顯著高于癌旁正常組織。此外，GLI4的表達水平與淋巴結轉移(N)分期具有相關性。因此，GLI4的表達水平可以作為結腸癌預后的潛在生物標志物。

本研究發現，過表達GLI4后結腸癌細胞LoVo和SW1116增殖、上皮間充質轉化能力和干性水平上升。GLI介導的轉錄調控與Hedgehog(HH)信號通路的下游效應器所發揮的作用有關，也稱為HH/GLI信號通路，GLI蛋白是Hedgehog(Hh)信號傳導的效應物，在胚胎發育期間參與許多細胞增殖和分化等過程，GLI轉錄因子具有DNA結合鋅指結構域，其結合靶基因上的共有序列以啟動或抑制轉錄[11]。有研究結果表明，轉錄因子GLI1在卵巢上皮癌中表達水平顯著高于卵巢正常上皮組織,在卵巢上皮癌中表達水平顯著高于卵巢上皮良性腫瘤,其在卵巢上皮癌細胞的高表達可能參與促進了卵巢癌的發生發展,推測轉錄因子GLI1可能作為卵巢上皮癌的治療靶點[12]。有研究發現，口腔鱗狀細胞癌病變過程中HH通路被異常激活，GLI2在該通路活化過程中發揮重要作用[13]。干擾GLI2表達可抑制口腔鱗狀細胞癌細胞的增殖、生長、遷移和侵襲。GLI2通過調控HH通路下游細胞遷移和侵襲標志基因及蛋白的表達而影響口腔鱗狀細胞癌細胞的遷移和侵襲。GLI3在肝內膽管細胞癌組織中表達較癌旁正常組織表達上調,并同腫瘤組織的腫瘤分化程度、淋巴結轉移、血管浸潤和腫瘤TNM分期密切相關。GLI3過表達可能與肝內膽管細胞癌的發生、發展、腫瘤侵襲及轉移行為有關,有望成為肝內膽管細胞癌的潛在的腫瘤靶標或預后評估指標[14]。因此，抑制GLI介導的轉錄激活可以成為治療各種人類惡性腫瘤的潛在的化療策略。

NK細胞可以根據CD56的相對表達細分為不同的亞群[15]。CD56brightNK細胞被認為是具有免疫調節特性的有效細胞因子生產者，在抗感染和抗癌防御中起關鍵作用[16]?？紤]到CD56brightNK細胞具有腫瘤殺傷作用，并且促癌因子GLI4的表達水平與其數量呈正相關，因此本研究檢測了GLI4是否促進CD56brightNK細胞抑制因子的分泌。本研究過表達GLI4后，結腸癌細胞LoVo和SW1116中CD56brightNK細胞抑制因子IL-4、IL-5、IL-6、IL-10的分泌水平上升。因此，即使在結腸癌組織中浸潤了很多CD56brightNK細胞，GLI4也可以促進相關細胞因子分泌來抑制CD56brightNK細胞的抗腫瘤功能。

綜上所述，高GLI4表達與結腸癌患者的癌癥進展和中位生存期顯著相關。GLI4可以促進結腸癌細胞的增殖水平、上皮間充質轉化能力和干性水平。此外，GLI4可以促進CD56brightNK細胞抑制因子IL-4、IL-5、IL-6、IL-10的表達。