三種紅樹根部組織抗氧化酶活性對水淹脅迫的響應

蘇柏予, 張維仕, 王友紹

1. 熱帶海洋環境國家重點實驗室(中國科學院南海海洋研究所), 廣東 廣州 510301;

2. 中國科學院大亞灣海洋生物綜合試驗站, 廣東 深圳 518121;

3. 南方海洋科學與工程廣東省實驗室(廣州), 廣東 廣州 511458;

4. 中國科學院南海生態環境工程創新研究院, 廣東 廣州 510301;

5. 中國科學院大學, 北京 100049;

6. 臨沂市白沙埠中學, 山東 臨沂 276035

紅樹林是以紅樹植物為主體的、由常綠灌木或喬木組成的潮灘濕地木本植物群落, 具有“四高”特性(高生產力、高歸還率、高分解率和高抗逆性), 是典型的海洋生態系統(王友紹, 2021; Wang et al,2021), 分布于熱帶及亞熱帶海岸, 具有重要的生態、社會和經濟意義(林鵬, 2001)。較一般陸生植物而言, 紅樹植物對各種極端環境具有耐受能力, 能較好地適應重金屬、石油烴、高溫等非生物脅迫(張以科, 2008; Zhang et al, 2012; 劉錦, 2018), 其中最廣為人知的是紅樹植物作為陸生植物對水淹脅迫的適應性, 這一適應性也使紅樹植物得以構成位于潮間帶受海水長期或周期性浸淹的紅樹林生態系統。

紅樹植物對水淹有強大的耐受機制, 但其能力并非無限。全球變化帶來的CO2濃度升高、海平面上升、紫外線輻射增強、海水鹽度的變化、降水量的變化、風暴增多等都會對紅樹林生態系統造成不同程度的影響 (Snedaker et al, 1994; Valiela et al,2001)。全球氣候變化對紅樹林的影響將是全方位的、立體的, 其中由于海平面上升、降水模式改變等所導致的水淹脅迫是不可忽視的重要影響因素(Ellison et al, 1997; Alongi, 2008)。就面對海平面上升而言, 紅樹林積累沉積物的能力可以跟上海平面每百年上升8 9cm 的速度(Ellison et al, 1991), 而每百年9 12cm 的上升速度則很有可能影響紅樹植物的生長, 從而影響紅樹林生態系統的穩定, 甚至導致該生態系統的消失(盧昌義 等, 1995)。潮汐實驗表明, 在一定浸泡閾值內, 水淹會刺激紅樹植物生長, 而超過閾值的水淹則會對植物生長和生物量帶來消極影響, 如白骨壤(Avicennia marina)小苗能較好地適應8 12h·d–1(廖寶文 等, 2010)的水淹; 紅花玉蕊(Barringtonia racemosa)能適應8h·d–1以內的水淹, 但10h·d–1水淹時會形成脅迫, 植株上調過氧化物酶(peroxidase, POD)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的酶活性(梁芳 等, 2021)。紅樹林生態系統位于海岸潮間帶, 相較其他生態系統受到高強度和復雜因素干擾的可能性更高(Alongi, 2008),受降水模式改變以及風暴潮等極端天氣頻發的影響,低洼地帶紅樹林易受非潮汐性的長時間水淹影響,不少研究表示了對全球氣候變化背景下紅樹林生態系統的長期維持和生存的擔憂(Valiela et al, 2001;顏秀花 等, 2019; 黃雪松 等, 2021)。因此, 迫切需要在各生態學水平上對紅樹林生態系統進行更透徹的研究, 從而為其提供更好的保護并積極恢復其生態原貌。

紅樹植物的表面根、氣根、板狀根、支柱根等特殊且強大的根系牢固根植于灘涂并適應海水浸泡(王友紹, 2019)。由于氧氣在水中的傳遞速率遠低于空氣, 潮汐帶來的水淹會導致紅樹植物根部缺氧并阻斷有氧呼吸(譚淑端 等, 2009), 處于低氧環境的細胞進行無氧代謝, 使無氧呼吸相關酶的活性增強,從而催化相關反應發生(Gibbs et al, 2003; Voesenek et al, 2006)。同時, 被淹植物組織內的活性氧生產和消除的平衡體系會遭到破壞, 導致活性氧(reactive oxygen species, ROS)的大量產生和累積(Mittler et al,2004)。在正常閾值內ROS 對植物細胞的生長和凋亡、脅迫響應等過程具有調控作用, 而過量的ROS會損害蛋白質、脂質及DNA; 損害細胞和組織; 從而對植株造成活性氧傷害( Ellison et al, 1991;Mittler et al, 2004; 譚淑端 等, 2009; Sairam et al,2009 ;張夢如 等, 2014)。SOD、過氧化氫酶(catalase,CAT)、抗壞血酸氧化酶(ascorbic acid oxidase, APX)與POD 與活性氧的消除有關, 它們在植物受脅迫后上調活性可保護植物免受活性氧傷害或降低活性氧帶來的傷害, 對植物在逆境下的存活至關重要, 如木欖(Bruguiera gymnorrhiza)和秋茄(Kandelia candel)會因長期水淹上調POD 和SOD 酶活性 (Ye et al,2003); 虎尾草(Chloris virgata)遭受水淹脅迫后SOD、POD 及CAT 酶活性上升(夏斌 等, 2019); 小蓬草(Conyza canadensis)會提高組織內SOD 活性以應對水淹脅迫(楊玲 等, 2020)。

分子和個體水平的差異導致紅樹植物不同種群對水淹脅迫耐受性的差異, 而物種的耐受性差異會對紅樹林群落結構和物種分布帶來影響。研究指出,紅樹植物的種群分布表現為過渡替代的交錯分布,白骨壤和桐花樹(Aegiceras corniculatum)種群密度由海向陸遞減, 而木欖種群密度則相反地集中于高潮帶, 這樣的差異分布與潮汐浸泡程度、沖刷程度和底層營養鹽濃度等一系列因素有關(溫遠光 等,2002)。因此, 本研究以紅樹植物自然種群分布為根據, 選擇水淹為本實驗探究的影響因子, 以在我國南方海岸帶具有代表性的木欖、桐花樹和白骨壤為實驗物種, 通過設置高水位浸淹模擬極端條件下的水淹環境, 從氧化損傷的角度研究紅樹植物抗氧化酶系統對水淹脅迫的響應機制, 旨在更好地了解紅樹林對水淹脅迫的生理適應機制, 為紅樹林生態系統的保護與管理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2021 年3 月8 日于廣東省湛江市采購株高約40cm、無病蟲、無機械損傷的木欖、桐花樹和白骨壤幼苗, 紅樹幼苗連同根部粘連泥土一同放置于塑膠周轉箱中運回實驗室。運輸后的植株置室外恢復兩周, 洗去植物根部土壤, 轉移至干凈河沙培養盆中, 澆灌1/2 Hoagland 營養液, 放置于條件為25℃、75%濕度、每日20000Lux 光強照射14h 的人工氣候箱中進行為期7d 的馴化培養。水淹深度設置為沙面以上25cm, 約沒過植株最靠近根部一對葉。分別在深淹處理1、3、5、7、14d 后收集植物根部組織, 同時采集未經深淹處理的0d 根部組織為對照。樣品收集后被立即置于液氮中速凍處理并迅速轉移至–80℃冰箱短暫保存待測。每一處理時間下的樣品均設置3 個生物學重復實驗。

1.2 測定方法

1.2.1 酶組織液準備

酶儲備液的制備參考崔雪 等(2018)的方法, 將根組織樣品在4℃磷酸緩沖溶液中漂洗, 吸水紙擦除水分并剪碎。準確稱量0.2g 組織樣品與1.8mL 勻漿介質混合。低溫研磨, 保證研磨充分、細胞徹底破碎。CAT、POD、SOD 的酶儲備液為組織研磨液以 4000r·min–1離心 15min 后吸取的組織上清液,APX 酶儲備液為組織研磨液以10000r·min–1離心10min 后吸取的組織上清液。

1.2.2 酶活性測定

CAT、POD、SOD、APX 活性測定參照Zhu 等(2020)的方法, 使用南京建成生物工程研究所相應的試劑盒分別對四種酶的活性進行測定。

1.3 數據分析

所有數據根據平行樣本測定所得值以平均值和標準差表示(M±SD), 利用SPSS 23.0 軟件的單因素方差分析(one-way ANOVA)方法對不同處理樣品間差異進行評價, 顯著性差異水平設置為P＜0.05, 采用 Waller-Duncan 法進行多重比較, 運用軟件Graphpad Prism 8.0.2 作圖使結果可視化。為了更直觀地觀察各物種、各處理時長之間抗氧化酶活性的相似性, 利用RStudio 對各組數據進行標準化處理,并按照完全聚合的比對方法進行層次聚類分析并繪制樹狀圖。

2 結果與分析

2.1 深淹處理對POD 活性的影響

桐花樹和木欖POD 活性在實驗所設置的浸淹周期內呈現隨時間持續上升的趨勢(圖1)。桐花樹浸淹1d 后根組織POD 活性到達367.188U·g–1, 較對照組0d 的197.049U·g–1極顯著上升(P＜0.01), 且在1d至7d 內都維持較高活性水平, 而14d POD 活性又較7d 再次顯著增長(P＜0.01), 達到實驗周期內的峰值696.037U·g–1, 約為對照組的3.5 倍。木欖浸淹1d 后根組織POD 活性到達181.424U·g–1, 較對照組0d 的82.951U·g–1顯著上升(P＜0.01)隨后保持較高活性水平, 在7d 后其活性又達新高375.868U·g–1, 而活性最高的14d 組織POD 活性396.111U·g–1約為對照組的5 倍。白骨壤POD 活性在受水淹脅迫1d 后顯著上升(P＜0.01)達500.463U·g–1, 隨后在3d 處呈下調態勢, 隨后再逐日增加(圖1), 其活性峰值在第1 天,為對照組1.4 倍。

圖1 不同水淹時間下3 種紅樹植物根組織的POD 活性Fig. 1 The POD activity in root tissues of different mangrove plants for different periods of submerge

2.2 深淹處理對SOD 活性的影響

3 種紅樹植物SOD 活性在水淹后均呈顯著上升后下降趨勢(圖2)。白骨壤SOD 活性在3d 達到峰值358.119U·g–1, 較0d 的170.060U·g–1上調約2倍。如圖2 所示, 白骨壤SOD 活性在7d 恢復到受脅迫前水平并在繼續下降, 在 14d 達到最低點62.864U·g–1。桐花樹SOD 活性在1～5d 內持續上升并在處理后5d 達到峰值746.598U·g–1, 為對照組405.956U·g–1的1.8 倍, 同樣, 其SOD 活性在處理周期后半段下降到了未處理的 0d 水平之下107.89U·g–1。木欖SOD 活性在1～7d 內較對照組而言處于高活性水平狀態, 峰值 627.582U·g–1出現在5d, 為對照組340.657U·g–1的1.8 倍。而14d活性最低, 僅69.172U·g–1。

圖2 不同水淹時間下3 種紅樹植物根組織的SOD 活性Fig. 2 The SOD activity in root tissues of different mangrove plants for different periods of submerge

2.3 深淹處理對CAT 活性的影響

如圖3 所示, 白骨壤CAT 活性在1～7d 內較0d顯著上調, 最高值109.084U·g–1出現在7d, 為對照組(60.923U·g–1)的1.8 倍, 且在高活性期間各時間點的酶活性差異較小, 14d 其活性回歸至對照組水平。桐花樹CAT 活性在處理后的1～5d 內呈現緩慢上升態勢, 7d 活性達到最高 176.189U·g–1, 為對照組(64.701U·g–1)的2.7 倍, 在14d 期回到較低水平。木欖CAT 活性峰值131.781U·g–1出現在5d, 約為對照組(51.267U·g–1)的2.6 倍, 隨后雖緩慢下降但仍處于對照組之上, 即在處理周期內均處于上調水平。

圖3 不同水淹時間下3 種紅樹植物根組織的CAT 活性Fig. 3 The CAT activity in root tissues of different mangrove plants for different periods of submerge

2.4 深淹處理對APX 活性的影響

如圖4 所示, 白骨壤APX 活性在深淹處理的1d和3d 期間顯著上調, 其中最高的2.512U·g–1出現在1d, 約為0d 0.582U·g–1的4.3 倍, 隨后活性下降回到與對照組無顯著差異水平。桐花樹受脅迫后APX 活性變化趨勢與白骨壤相似, 在1d 和3d 顯著上調隨后下降, 其中1d 活性最高達到0.825U·g–1, 約是對照組0.284U·g–1的3 倍。木欖受脅迫后在1d 處APX活性達到最高0.995U·g–1, 約為對照組0.500 的2倍, 而隨后的3～14d 處活性均逐步下降并回到對照組水平。

圖4 不同水淹時間下3 種紅樹植物根組織的APX 活性Fig. 4 The APX activity in root tissues of different mangrove plants for different periods of submerge

3 討論

如圖5 所示, 實驗所涉及的4 種活性氧清除相關酶活性均在3 種紅樹植物受水淹脅迫后上升, 幫助植物應對低氧脅迫造成的ROS 異常。 POD 活性在試驗周期內(14d)持續上升, SOD、APX、CAT 的活性在試驗周期內呈先上升后下降趨勢。在Ye 等(2003)的研究中, 木欖在12 周的水淹周期內根組織POD 活性持續上升, 秋茄水淹后根組織POD 活性則是在8 周內持續上升。

圖5 3 種紅樹植物各酶活性水平熱圖Fig. 5 Heatmaps of enzymes activities of three mangrove plants

研究表明, 植物受長期水淹后POD 活性變化一般呈現兩種趨勢: 先上升后下降趨勢與持續上升趨勢, 如華北紫丁香葉片(白果 等, 2021)、棱角山礬幼苗葉片(趙楚 等, 2021) POD 活性分別在10d、38d下降; 而水竹根系(金藝 等, 2021)、虎尾草根系(夏斌 等, 2019)和雙穗雀稗根系(譚淑端 等, 2013)POD活性在各自的實驗周期內(分別為15d、30d 和150d)都呈現持續上升態勢。POD 活性在受水淹植物的根系和葉片呈現兩種變化趨勢展示了植物不同組織內POD 對水淹脅迫的應對機制, 在水淹實驗中根組織長期處于脅迫環境可能是導致不同植物根組織POD活性在各自實驗周期內都持續增長的原因。

植物在遭水淹脅迫后有氧呼吸受阻, 植物細胞開始進行無氧呼吸, 無氧呼吸會導致有害物質乳酸和乙醇在細胞中的累積(Gibbs et al, 2003)。POD 除了能與H2O2反應, 它還參與某些有毒物質如醇類、酸類和酚類的反應, 在這類反應中的副產物正是ROS, 其具體反應過程如下(Hiraga et al, 2001;Kawano, 2003)。

E 為POD, EI、EII 為反應過程中的POD 復合物;AH 為反應底物; A·為底物的自由基態;為氧自由基。本研究中3 種紅樹植物POD 活性在受脅迫期間較其他酶而言其趨勢沒有出現隨處理時間延長而相對下降的變化。這可能與其不僅與過氧化氫反應還可能參與細胞對乳酸和乙醇的解毒過程有關。 有研究表明, 在敲除基因或利用反義互補方法阻止APX1 和CAT2 表達的實驗中, 特定種的POD(classⅢ)表達會上調(Mittler et al, 2004), 這一類實驗表明了ROS 產生后POD 對植物的保護, 結合本研究的實驗結果, 推測POD 在紅樹植物遇較長時間的水淹脅迫后可為植物提供較長期的保護。

SOD、APX 和CAT 對ROS 的消除和平衡具有重要作用。SOD 可以催化結合H+生成過氧化氫和氧氣。過氧化氫被 APX 催化生成水和丙二醛(malondialdehyde, MDA); CAT 也可催化過氧化氫并生成水和氧氣。SOD 是向H2O2轉化的關鍵, 而CAT 和APX 的活性則關系到H2O2的清除(Hiraga et al, 2001; Kawano, 2003)。

從圖5 的SOD 熱圖中可以看到, 與對照組0d相比在1～5d 的時間內SOD 活性增強, 紅樹植物根部細胞積極響應組織內上升的氧自由基。在7d 的取樣點處, SOD 活性較之前下降并基本回到受脅迫前水平, 而14d 處的采樣點SOD 活性甚至降低至0d處酶活性水平以下, 這與飼料桑苗(Morus alba)和濕地松(Pinus elliottii)的水淹實驗SOD 活性先增后減的趨勢一致(崔雪 等, 2018), 表明SOD 作為一種應激表達的蛋白并不能在紅樹植物受水淹脅迫時長期維持在高活性狀態。水淹脅迫使CAT 與APX 活性在短期內增強。與SOD 相似, CAT 與APX 活性同樣不能長時間維持在高水平。CAT 與APX 底物均為H2O2, 由這兩種酶的變化趨勢推測, 水淹發生時CAT 可在更長時間內保護植物免受H2O2威脅, 在水淹脅迫下對ROS 的清除起更重要作用。實驗結果表明活性氧清除有關的酶是應激表達的, 紅樹植物應對長期的水淹脅迫還有賴于其他生理結構和生化途徑, 如通氣組織的形成和側根的生長等。

三種紅樹植物在自然生態系統中的帶狀分布是不同高程海岸帶各環境因子共同作用的結果, 而潮汐所帶來的浸泡時間長短與水位高低是其中的關鍵因子之一。模擬極端水淹條件后白骨壤、桐花樹和木欖的ROS 清除酶活性的變化趨勢并沒有出現十分顯著的差異, 雖然針對某一種酶的表達量會存在物種間的差異, 就單因素方差分析而言, 其變化趨勢上的共性不能區分三種紅樹植物抗氧化酶的活性模式, 于是本研究選擇聚類分析進行更進一步的討論, 旨在更直觀表現三種紅樹植物的抗氧化酶對水淹脅迫響應模式的相似或相異性。

以每一處理時長下3 種紅樹植物各項酶活性為指標, 按照層次聚類的方法對其進行分析, 其結果以樹狀圖形式展示。如圖6 所示, 當聚類數為2 時各目標被聚集分為A 組和B 組, 白骨壤各處理組全部聚集于A 組, 而桐花樹除7d 和14d, 木欖除14d外聚集于B 組。從聚類的角度, 白骨壤在水淹脅迫下的各項抗氧化酶活性模式較桐花樹和木欖存在一定差異, 而在較長時間水淹脅迫處理下的桐花樹和木欖抗氧化酶的各項響應模式趨向于白骨壤的活性模式。在B 組中, 桐花樹0d 與木欖0d 被聚集于同一分支下, 其余處理天數則位于另一分支, 表明未受水淹的桐花樹和木欖組織內各項酶活性以相似的模式表達, 水淹發生后這兩種植物酶系響應并具有相似的上調模式。白骨壤1d 和3d 被分為C 組, 其余天數處理下的各項位于D 組, 這表明白骨壤在脅迫發生后的3d 內各指標出現變化而后迅速恢復。白骨壤與桐花樹、木欖各指標的差異可能是白骨壤作為“先鋒樹種”對水淹脅迫具有良好耐受能力的原因之一, 就桐花樹和木欖兩物種而言, 本實驗分析認為二者在各處理組中抗氧化酶指標活性模式是相似的, 因此這兩種植物在潮間帶高程分布的差異可能由其他因素主導。

圖6 酶活性水平聚類分析樹狀圖各分支標簽中am 為白骨壤, ac 為桐花樹, bg 為木欖; 標簽數字尾綴代表水淹處理天數Fig. 6 Dendrogram derived from cluster analysis of enzymes activities. In the labels of each branch, am represents A. marina,ac stands for A. corniculatum and bg means B. gymnorrhiza. The label number represents the periods of submerged stress

4 結論

抗氧化酶APX、SOD、CAT 和POD 對3 種紅樹植物受水淹脅迫后的活性氧消除至關重要。聚類分析中3 種植物0d 的酶活性機制與處理后的差異,強調抗過氧化酶對水淹脅迫的響應。單因素方差分析表明, 4 種抗氧化酶在水淹發生后均顯著上升, 其中APX、SOD、CAT 的酶活性在3 種植物中均表現出先上升后下降的趨勢, 其峰值基本出現在7d 以前,表明這3 種酶在脅迫發生早期發揮作用, 可以幫助植物應對非生物脅迫; POD 活性在14d 內持續增長并沒有出現明顯的下調趨勢, 這可能與其特殊的酶功能有關。

層次聚類發現白骨壤各項酶指標的活性機制與桐花樹和木欖的存在差異。此分析方法沒有發現桐花樹與木欖間明顯的差異。酶活性機制的差異可能在一定程度上有助于白骨壤應對潮汐帶來的脅迫,結合生理和結構上的優越性使其成為向海的“先鋒樹種”。因此, 建議在進行紅樹林人工生態修復時應遵循自然種群的高程分布特點, 如白骨壤具有優秀的耐水淹能力, 適合種植于沿海低洼地帶和較低潮間帶。