紅海欖肉桂酸-4-羥基化酶基因的克隆與表達分析

謝勇 , 王友紹, 張維仕

1. 熱帶海洋環境國家重點實驗室(中國科學院南海海洋研究所), 廣東 廣州 510301;

2. 中國科學院大亞灣海洋生物綜合試驗站, 廣東 深圳 518121;

3. 中國科學院南海生態環境工程創新研究院, 廣東 廣州 510301;

4. 中國科學院大學, 北京 100049;

5. 南方海洋科學與工程廣東省實驗室(廣州), 廣東 廣州 511458;

6. 臨沂市白沙埠中學, 山東 臨沂 276035

紅樹林作為四大高生產力的海洋生態系統之一,具有“四高”特性, 在改善近海生態環境、凈化水質、防浪護岸和保護生物多樣性等方面具有不可替代的重要作用 (王友紹, 2019; Wang et al, 2021)。近年來,隨著工農業的快速發展, 不規范的海水養殖等導致沿海地區污染嚴重, 其中重金屬污染較為常見(王友紹 等, 2019)。紅樹林沉積物中重金屬濃度的增加在全世界都有記錄(Tam et al, 1997)。多項研究證實,紅樹林已成為重金屬污染物的重要儲存庫(Usman et al, 2013; Bourgeois et al, 2019)。大量重金屬污染物的輸入給紅樹植物的生長發育帶來了嚴峻的挑戰。紅海欖是一種廣泛分布于我國南方沿海的紅樹科植物, 經常作為紅樹林恢復種進行人工種植, 具有較強的抗重金屬脅迫能力。木質素合成反應是紅海欖耐受重金屬脅迫的一個重要機制。植物細胞木質素的合成有利于增加細胞壁厚度, 阻止金屬離子進入細胞, 減小重金屬脅迫對植物的損害(芮海云 等,2019)。肉桂酸-4-羥基化酶是植物中分布最廣的細胞色素P450 單加氧酶家族成員, 是苯丙烷途徑中第二步反應的關鍵酶(Fahrendorf et al, 1993), 催化反式肉桂酸生成 4-香豆酸, 對木質素的合成有促進作用。迄今為止, 許多陸地植物的C4H基因被克隆分析, 如荸薺C4H基因(宋慕波 等, 2020)、海南龍血樹C4H基因(梁惠楨 等, 2018)、紫蘇C4H基因(宋西紅 等, 2015)、茶樹C4H基因(姚勝波 等, 2015)等, 但關于紅樹植物C4H基因序列及其抗逆功能研究很少 (宋暉 等, 2012)。

本研究利用同源克隆和RACE 技術, 從紅海欖中克隆得到了肉桂酸-4-羥基化酶基因的cDNA 全長,并運用生物信息學方法對該基因進行預測分析, 以紅海欖18S rRNA 作為內參基因, 檢測紅海欖葉片中C4H基因表達情況與重金屬處理時間的關系。本研究為進一步了解C4H基因在紅海欖響應重金屬脅迫過程中的作用, 以及利用基因工程手段提高紅樹植物耐受重金屬脅迫的能力提供了基礎資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物材料: 實驗用的紅海欖幼苗采自廣東省湛江市紅樹林育苗基地, 挑選長勢良好的幼苗移至26℃人工氣候培養箱進行培養, 用人工配置的混合重金屬水溶液(Cu2+112.5mg·L–1、Pb2+22.5mg·L–1、Cd2+4.5mg·L–1、Hg2+4.5mg·L–1)進行脅迫處理。

試劑盒: RNAprep Pure Plant Kit(Polysaccharides$ polyphenolics-rich)多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒(天根生化科技有限公司, Cat: DP121221);PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)反轉錄試劑盒(TAKARA, Code No.RR047A); CISTROME(Cat,#E0104S) 混合酶;StarPrep Gel Extraction Kit 膠回收試劑盒(GenStar 公司 ); SMARTer? RACE 5′/3′ Kit (Clontech,No.634858)試劑盒。

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA 提取與反轉錄

紅海欖葉片總RNA 的提取采用試劑盒的方法進行, 提取完成后利用NanoDrop Lite 型號紫外分光光度計檢測 RNA 樣品的濃度和純度(OD260nm/OD280nm), 要求RNA 樣品濃度高于30ng·μL–1, OD 比值在1.8～2.1 之間, 紅海欖總RNA 經檢測合格后進行反轉錄反應生成cDNA, 反轉錄反應采用試劑盒方法, 操作方法見說明書。

1.2.2 中間片段克隆

從NCBI 網站下載薔薇超目植物的C4H 氨基酸序列, 將序列導入Base-by-Base 尋找保守區域, 將所得結果導入 j-CODEHOP 設計兼并引物C4H-F 和C4H-R 進行中間片段克隆(表1), 以紅海欖cDNA 為模板, 使用CISTROME(Cat,#E0104S)混合酶進行中間片段克隆擴增, PCR 程序設置為95℃預變性3min,94 ℃ 30s、55℃ 30s、72 ℃ 1min, 35個循環, 72℃延伸10min, 反應結束后對PCR 產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳得到C4H基因中間片段, 利用試劑盒方法進行膠回收后送往華大基因公司測序。

表1 引物列表Tab.1 Primer list

1.2.3C4H基因cDNA 全長擴增

以紅海欖C4H基因中間片段為模板, 利用Promer5.0 設計RACE 反應中的特異性引物。3′端反應體系的配制與RACE 試劑盒說明書一致, 擴增程序如下, 94 ℃ 30s、62 ℃ 30s、72 ℃ 3min, 28個循環。5′端按照RACE 試劑盒方法得到條帶不清晰,故以RACE 試劑盒中反轉錄生成的第一鏈cDNA 為模板, C4H-NGSP-5′和UPM 為引物進行PCR 擴增,程序如下95℃預變性3min, 94 ℃ 30s、53 ℃ 30s、72 ℃ 1min, 35個循環, 72℃延伸10min, PCR 產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳后膠回收送往華大基因公司測序, 得到3′和5′端序列后進行拼接得到C4H基因cDNA 全長。

1.2.4C4H基因生物信息學分析

生物信息學分析所利用的軟件、網址等詳見表2。

表2 生物信息學分析軟件或網址Tab. 2 Bioinformatics analysis software or website

1.2.5 基因表達差異分析

為研究重金屬處理下RsC4H基因的表達變化情況, 在重金屬處理后的第0h、3h、6h、12h、1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、10d 分別剪取3 片新鮮的、無機械損傷的嫩葉進行qRT-PCR 反應, 本實驗采用非特異性 SYBRGreenI 染料法在杭州博日FQD-96AQPCR 儀中進行。qRT-PCR 引物詳見表1,以紅海欖 18S rRNA 作為內參基因, 實驗結果用2–ΔΔCT表示。利用SPSS21 進行單因素方差分析, 分析不同處理時間下紅海欖葉片RsC4H基因的表達量與初始表達量之間的差異, 標注*的數據代表與對照組具有顯著性差異(P＜0.05)。

2 結果與分析

2.1 RsC4H 基因的克隆

將3′和5′端序列進行拼接后得到紅海欖C4H基因的cDNA 全長, 將其命名為RsC4H基因。RsC4H基因全長為2006bp, BLAST 比對結果顯示其與銀白楊C4H基因(Populus alba, XM_035065468.1)同源性高達83.49%, 與山葡萄C4H基因(Vitis amurensis,MH045992.1)同源性達84.46%, 與橡膠樹C4H基因(Hevea brasiliensis, XM_021825151.1) 同源性達82.69%, 證明克隆得到的基因全長確實是紅海欖的C4H基因序列。RsC4H基因從271 號核苷酸到1842號核苷酸為開放閱讀框區域, 開放閱讀框長1572bp,共編碼523 個氨基酸(圖1)。

圖1 RsC4H 基因的ORF 與編碼氨基酸序列Fig. 1 ORF and coding amino acid sequence of RsC4H gene

2.2 RsC4H 蛋白理化性質分析

RsC4H 蛋白的理化性質結果顯示, 紅海欖C4H蛋白相對分子量為60.18kD, 預測等電點為8.96。其中包含異亮氨酸(Leu)60 個占整個氨基酸序列的11.5%, 纈氨酸(Val)42 個占8.0%, 帶負電荷的殘基總數 Asp + Glu 共63 個, 帶正電荷的殘基總 Arg +Lys 共 71 個, 原子總數 8567 個, 分子式為C2748H4317N743O742S17, 脂肪族指數為99.87, 親水性的平均值(GRAVY)為–0.168(＜0), 是親水性蛋白質,不穩定指數為44.09(>40), 屬于不穩定蛋白。將紅海欖C4H 氨基酸序列輸入ProtScale 在線分析紅海欖C4H 蛋白的疏水-親水性, 結果顯示RsC4H 蛋白在N 端有一個明顯的疏水峰, 在C 端有兩個比較明顯的疏水峰。在第19 位氨基酸的疏水性最強, 分值達到3.611, 在第416 位氨基酸的親水性最強, 分值是–2.711, 整體上親水區更多, 親水性的平均值為–0.168, 為親水性蛋白。

2.3 RsC4H 蛋白二級結構與三級結構預測

利用SOPMA 在線軟件對RsC4H 蛋白的二級結構進行預測, 結果顯示RsC4H 蛋白包含47.42%的α 螺旋(Alpha-helix), 15.11%的β 折疊(extended strand), 4.78%的β 轉角(beta-turn)和32.70%的無規則卷曲(random coil), 紅海欖C4H 蛋白的二級結構以α 螺旋和無規則卷曲為主。利用SWISS-MODEL在線軟件進行三維模型構建, 以高粱C4H(6vby.1.A)三維模型為模板, 氨基酸序列同源性達76.53%, 構建出紅海欖的C4H 蛋白的三維模型(圖2)。結果顯示RsC4H 蛋白含有大量的α-螺旋,中間由無規則卷曲進行連接, 這與SOPMA 二級結構的預測結果保持一致。

圖2 紅海欖C4H 蛋白的三維模型(SWISS-MODEL)Fig. 2 Three-dimensional model of RsC4H protein(SWISS-MODEL)

2.4 RsC4H 蛋白跨膜螺旋與信號肽預測

利用TMHMM 2.0 在線工具對RsC4H 蛋白進行跨膜螺旋預測, 結果顯示 RsC4H 蛋白共有兩個跨膜螺旋結構, 在肽鏈的N 端和C 端各含一個, 1—3號氨基酸在膜結構外側, 4—23 號氨基酸為跨膜螺旋,24—503 號氨基酸在膜結構內側, 504—522 號氨基酸為跨膜螺旋, 523 號氨基酸在膜結構外側。利用SignalP 4.0 Server 對RsC4H 蛋白信號肽進行分析,結果顯示其Y值、S值很小, 均小于0.5, 表明該蛋白不存在信號肽酶切位點, 紅海欖C4H 蛋白沒有信號肽。

2.5 RsC4H 蛋白保守結構域查詢與亞細胞定位

利用NCBI 網站Conserved Domain Search 功能尋找保守結構域, 結果顯示紅海欖C4H 蛋白含一個保守結構域PLN02394, 屬于細胞色素P450 超家族。對RsC4H 蛋白進行亞細胞定位分析, 預測結果顯示紅海欖的C4H 蛋白是一種膜結合蛋白, 主要存在于膜結構上或內質網上。

2.6 RsC4H 蛋白系統發育樹構建

由于目前對紅樹植物的C4H基因研究很少, 除秋茄C4H基因的部分cDNA 序列被克隆出來以外,基本找不到紅樹植物的C4H 氨基酸序列或基因序列,所以將紅海欖的C4H 蛋白與從NCBI BLAST 結果中選取的麻風樹(Jatropha curcas, XP_01207817 6.1)、決明(Senna tora, KAF7816240.1)、筍瓜(Cucurbita maxima, XP_023007159.1)、南瓜(Cucurbita moschata, XP_022947682.1)、雷公藤(Tripterygium wilfordii, XP_038693505.1)、蓮花(Nelumbo nucifera, XP_010253046.1)、芍藥(Paeonia lactiflora, AGG55322.1)、橄欖(Canarium album,ACR10242.1)、喜樹(Camptotheca cuminata, ANR763 95.1)、可可樹(Theobroma cacao, EOY20175.1)、地黃(Rehmannia glutinosa, QOJ53928.1)美國黑樹莓(Rubus occidentalis, ACM17896.1)等12 個植物的C4H 蛋白, 用 MEGA6 中 Phylogeny 模塊下的Neighber－joining 方法, Bootstrap 值設置為1000,構建了系統發育樹, 分析不同物種的C4H 蛋白之間的進化關系(圖3) , 系統發育樹結果顯示紅海欖和筍瓜(CuCurbita maxima, XP_023007159.1)、南瓜(CuCurbita moschata, XP_022947682.1)的C4H 蛋白聚在一個小分支, 表明它們的親緣關系更近, 而南瓜、筍瓜與紅海欖都屬于薔薇超目, 系統發育樹的結果與它們在植物分類系統上的地位一致, 表明系統發育樹具有可信度。

圖3 C4H 蛋白的系統發育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of C4H protein

2.7 RsC4H 基因表達差異分析

利用qRT-PCR 技術檢測紅海欖幼苗在遭受重金屬脅迫10 天內葉片中C4H基因的表達情況, 結果如圖4 所示。RsC4H基因在重金屬脅迫下除在第3h表達量顯著高于初始值外, 其他時間內表達量與初始值無顯著差異(P>0.05)。RsC4H基因在重金屬脅迫下的3h 內大幅上調, 在第3h 時表達量達到最大值, 顯著高于初始表達量(P＜0.05), 達到處理前的4.29 倍, 隨后迅速回落, 從第6h 到第6 天RsC4H基因表達量均略低于初始表達水平, 小幅度波動, 從第7 天之后逐漸穩定, 在第10 天時表達量為初始表達量的1.66 倍左右, 但是差異并不顯著。整體上,重金屬脅迫下紅海欖C4H基因的表達水平有所提高, 這有利于木質素的合成, 增加細胞壁厚度, 進而阻止金屬離子進入細胞, 減弱金屬離子對植株的損害。

圖4 重金屬脅迫下紅海欖C4H 基因的表達情況Fig. 4 The expression of RsC4H gene under heavy metal stress

3 討論

苯丙烷代謝途徑可合成多種植物次生代謝產物,包括黃酮類化合物、木質素、香豆素等, 是植物重要的次生代謝途徑, 在植物生長發育、機械支持、防御反應等方面發揮重要作用(Winkel-Shirley,2001)。苯丙烷代謝途徑由苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶的作用下生成反式肉桂酸, 反式肉桂酸在肉桂酸-4-羥化酶催化下生成香豆酸, 香豆酸在4-香豆酸輔酶A 連接酶的作用下產生香豆酰輔酶A, 然后進入黃酮、木質素等化合物的下游合成途徑。當植物中C4H基因的表達受到抑制時, 植物木質化程度降低,總木質素含量以及木質素單體的含量降低, 據此認為C4H基因的表達直接影響植物木質素的合成(Blee et al, 2001; Sykes et al, 2015) 。而植物木質素含量的增加可以增加細胞壁的厚度, 阻止重金屬離子進入細胞, 細胞壁的阻擋作用是植物耐受重金屬脅迫的第一道屏障, 因此C4H基因的表達對于植物耐受重金屬脅迫有重要作用。

本研究利用同源克隆技術和RACE 方法擴增得到了紅海欖C4H基因的cDNA 全長, 其開放閱讀框長1572bp, 共編碼523 個氨基酸。紅海欖C4H 蛋白是不穩定的親水性蛋白, 有一個P450 功能結構域,在N 端和C 端分別含有一個跨膜螺旋, 無信號肽, 亞細胞定位顯示其是一種膜結合蛋白, 主要在膜結構或內質網上發揮功能, 二級結構主要為α 螺旋和無規則卷曲。通過構建系統發育樹發現, 紅海欖和筍瓜、南瓜的C4H 蛋白聚在同一個小分支, 它們的C4H 蛋白親緣關系更近。系統發育樹中的標尺為0.01, 指遺傳變異度為1%, 表明發育樹中各物種的C4H 蛋白變化度很小, C4H 蛋白保守性很強, 預測由于C4H 蛋白是植物響應逆境脅迫的重要酶, 所以具有比較高的遺傳穩定性, 物種間的差異較小。

肉桂酸-4-羥基化酶基因可以受多種脅迫條件誘導表達, 比如寒冷、水楊酸、脫落酸處理等都會誘導植物C4H基因的表達(Cheng et al, 2018), 海南龍血樹在脫落酸、油菜素內酯、茉莉酸、紫外線等多種脅迫處理時,DcC4H基因的表達量均會上調(梁惠楨 等, 2018), 而肉桂酸-4-羥基化酶可以介導木質素的合成(Umemoto et al, 2016)。C4H基因在大麻葉中的高度表達導致了木質素含量的增加(Docimo et al, 2013), 蓮霧果實C4H基因的表達水平和木質素含量呈正相關關系, 且兩者的相關系數高達0.972 (黃利娜 等, 2020), 以上研究均證實了C4H基因的表達對于木質素的合成有促進作用。本研究中,紅海欖在遭受重金屬脅迫時,C4H基因的表達量先快速提高, 在第3h 時表達量達最大值, 這表明該基因對重金屬脅迫的響應十分迅速, 在受到重金屬脅迫后快速提高了C4H基因的表達量, 促進木質素的生成, 阻止金屬離子進入細胞, 隨后表達量出現快速回調, 但隨著脅迫時間的延長,C4H的表達量也開始逐步穩定, 雖然與對照組無顯著差異, 但有高于初始表達水平的趨勢。在重金屬脅迫下紅海欖C4H基因表達量整體上表現出上調趨勢, 據此認為RsC4H基因參與了紅海欖抗重金屬脅迫的響應過程,促進了木質素的生成, 阻止金屬離子進入細胞, 對于紅海欖耐受重金屬脅迫有積極作用。

4 結論

本研究克隆得到了紅海欖C4H基因的 cDNA全長, 其開放閱讀框長1572bp, 共編碼 523 個氨基酸, 編碼蛋白的相對分子量為60.18kD, 包含2 個跨膜螺旋結構和一個P450 家族功能結構域, 是一個不穩定的親水性蛋白, 無信號肽, 二級結構以α 螺旋和不規則卷曲為主, 亞細胞定位顯示主要在膜結構或內質網上發揮作用。紅海欖C4H 蛋白與其他物種的C4H 蛋白同源性很高, 預測它們的功能也相似,包括催化反式肉桂酸生成香豆酸、促進木質素的合成及參與多種脅迫應急反應。在重金屬脅迫下, 紅海欖C4H基因可以快速響應重金屬脅迫, 在紅海欖機體抗重金屬脅迫響應的初始階段就開始發揮作用, 促進木質素合成, 增加細胞壁厚度, 阻止金屬離子進入細胞對植株造成損傷。紅海欖C4H基因的成功克隆, 豐富了紅海欖抗性基因庫的內容, 為進一步探究紅海欖耐受重金屬脅迫的分子機制提供了基礎資料。