碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌耐藥機制研究進展

田雨，關曉雯，劉萌，魏蓮花

(1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省人民醫院，甘肅 蘭州 730000)

0 引言

耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌對全球公共衛生構成的威脅呈指數級增長，這些細菌具有多種多樣的耐藥機制，使得由碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌(CRKP)引起的感染控制和早期檢測變得困難。近年來，研究者們迫切需要制定新的治療指南來治療 CRKP感染以減緩耐藥性的出現。因此本文主要以 CRKP 耐藥機制、遺傳背景等對當前CRKP 感染的研究進行綜述，望為臨床有效治療CRKP 感染提供依據及參考。

1 流行性分析

肺炎克雷伯菌(klebsiellapneumoniae)是一種重要的腸桿菌科細菌，在醫院和社區獲得性感染中可導致多種感染，如呼吸道感染、尿路感染和血液感染等。隨著抗生素的頻繁使用，革蘭陰性桿菌(MDRGN)多重耐藥引起的感染已成為一個日益嚴重的全球性問題。碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌(Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP)可由于CRKP定植、碳青霉烯類暴露、較長的住院時間、重癥監護病房 (ICU) 停留時間和手術史而導致血流感染(Bloodstram Infection，BSI)，這些被認為是耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌血流感染(CRKP-BSI)的獨立危險因素[1-2]。同時，碳青霉烯類抗生素對產生多藥和廣譜β-內酰胺酶的菌株有效，但隨著碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌分離率的提高，肺炎克雷伯菌的耐藥性一直在增加[3]，由碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌(CRKP)引起的感染也越來越受到重視，臨床治療面臨新的困境[4-5]。

腸桿菌科細菌對強效抗生素碳青霉烯類抗生素耐藥性的對全球公共衛生的威脅日益嚴重。在我國，對碳青霉烯類抗生素的耐藥性監測顯示，對碳青霉烯類抗生素耐藥的腸桿菌科(CRE)數量逐年增加，其中CRKP占最重要的比例(64.2%)[6]。統計數據表明，2017年中國和歐洲的抗生素耐藥性監測網絡均顯示對碳青霉烯耐藥的肺炎克雷伯菌的檢出率有所提高：中國從2013年的4.9%增長至2017年的9.0%，而上海的驚人增幅為26.9%；同時歐洲CRKP的比率保持相對不變，從2014年的7.3%到2017年的7.2%，變化最大的是希臘從62.3到64.7%[7-8]。根據CHINET耐藥性網絡監測顯示，2005-2020年這16年肺炎克雷伯菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率從2005年的3.0%和2.9%持續上升至2018年的25.0%和26.3%，對亞胺培南的耐藥性從2016年的16.1%迅速上升至2017年的20.9%和2018年的25.0%，從2019年和2020年開始呈下降趨勢，但仍在23%以上[9-10]。因此，中國的CRKP耐藥性正在以令人震驚的速度上升，這使得人們越來越重視CRKP的耐藥機制研究。

2 耐藥機制

肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥性與不同的機制有關。碳青霉烯的肺炎克雷伯菌(CRKP) 通過兩種主要機制使碳青霉烯失活：(1)獲得編碼能夠水解碳青霉烯的酶的碳青霉烯酶基因——三種最重要的碳青霉烯酶類型是A類KPC型酶、B類金屬β-內酰胺酶(VIM、IMP、NDM) 和D類 OXA-48 型酶；(2)通過定量和/或定性缺乏孔蛋白表達以及對碳青霉烯類具有弱親和力的 β-內酰胺酶的過度表達來減少抗生素的堆積[11]。還可質粒型AmpC酶的過度表達和窗孔蛋白的丟失、碳青霉烯類高親和力位點PBP2的數量下降、親和力喪失或降低等有關[12,13]。通透性缺陷的同時產生的β-內酰胺酶具有非常弱的碳青霉烯酶活性，可能導致對碳青霉烯類藥物，特別是厄他培南的敏感性降低[14]。這些酶可以是Ambler A類超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)或Ambler C類AmpC頭孢菌素酶，其中一些酶(即CTX-M-15、CMY-2)在結合通透性缺陷時更有可能降低碳青霉烯類藥物的敏感性[15]。

2.1 A類KPC型β-內酰胺酶

肺炎克雷伯氏菌主要產生的是A類KPC型β-內酰胺酶[16]，目前已發現了20多種KPC變體，其中KPC-2和-3仍然是最常見的變體[17]。這些酶對青霉素，碳青霉烯類，頭孢菌素，頭孢菌素和單巴坦類產生耐藥性，并被β-內酰胺酶抑制劑(如克拉維酸(弱)，他唑巴坦(弱)，硼酸和阿維巴坦(avibactam)抑制[18]。目前產生KPC的細菌被認為是世界上某些地區的地方病，例如在美國東北部，波多黎各，哥倫比亞，希臘，意大利，以色列和中國，并且是其中某些地區和國家醫院獲得性感染的重要原因[19]。在耐藥性研究中心最主要的是帶有KPC-2和KPC-3的ST258的肺炎克雷伯氏菌，此外，還有研究表明GES-5是另一種A類碳青霉烯酶，是GES-1的點突變衍生物[20]。

2.2 B類β-內酰胺酶

在不同腸道細菌中也發現了肺炎克雷伯氏菌中鑒別出來的還有B類β-內酰胺酶或金屬-β-內酰胺酶(MBLs)獲得性金屬β-內酰胺酶(MBL)是一種碳青霉烯酶，可水解幾乎所有的β-內酰胺類抗生素(單酰胺類除外)[14]。主要有NDM型，VIM型和IMP型酶，其中NDM型是全世界最常見的酶。雖然IMP主要在中國、日本和澳大利亞被鑒定，但產VIM的肺炎克氏菌主要分布在意大利和希臘[14]。NDM-1與其他獲得性金屬β-內酰胺酶(MBL)幾乎沒有同一性，最相近的是VIM-1/VIM-2型，有32.4%的氨基酸具有同一性。自發現NDM-1以來，已經描述了該酶的10多種變體，其中大多數起源于亞洲[21]。MBLs的細菌通常對青霉素，碳青霉烯，頭孢菌素和頭孢菌素產生耐藥性，但對單桿菌素仍敏感，其活性受到金屬螯合劑(如EDTA和二吡啶甲酸)的抑制。大多數NDM-1產生菌還有多種其他抗藥性機制[14]，包括：質粒介導的AmpCβ-內酰胺酶(特別是CMY類型)，ESBLs(特別是CTX-M-15)，不同的碳青霉烯酶(例如OXA-48，VIM和KPC類型)，16S rRNA甲基轉移酶，質粒介導的喹諾酮抗性決定簇，大環內酯修飾酯酶和利福平修飾酶等。因此，帶有NDM型酶的腸桿菌科仍然對諸如大腸菌素，磷霉素和替加環素等藥物最敏感[20]。

2.3 D類 OXA-48 型酶

肺炎克雷伯菌分離株中發現的D類碳青霉烯水解β-內酰胺酶是OXA-48(及其衍生物)，首次發現于法國巴黎的土耳其耐多藥肺炎克雷伯菌分離株(MDR肺炎克雷伯菌)中[22]。OXA-48能有效水解窄譜β-內酰胺類藥物，如青霉素，弱水解碳青霉烯類藥物和廣譜頭孢菌素[23]。進一步的研究表明，這種產 OXA-48 的肺炎克雷伯菌共表達多種 β-內酰胺酶，包括 A 類超廣譜 β-內酰胺酶 (ESBL) SHV-2a 和窄譜 β-內酰胺酶 TEM-1 和 OXA -47，并且在幾種外膜蛋白中表現出缺陷，導致其高水平的抗生素抗性模式[24]。它在腸桿菌科的菌中都有發現，主要存在于肺炎克雷伯菌(主要來源于醫院)和大腸桿菌(主要來源于社區)的分離物中。產OXA-48的肺炎克雷伯菌在土耳其和某些北非和歐洲國家(如摩洛哥、突尼斯、西班牙、比利時)流行，并表現出廣泛的易感性特征[22]。事實上，碳青霉烯類抗生素的MIC在不同的分離物之間可能有很大的差異，這取決于宿主的通透性背景。類似地，對廣譜頭孢菌素的敏感性也會發生顯著變化，這取決于其他β-內酰胺酶(如ESBLs)的共同產生。在肺炎克雷伯菌中也發現了一些OXA-48衍生物，即OXA-181、OXA-204和OXA-232，它們都具有類似的水解特性[25]。這些酶已在北非、澳大利亞和新西蘭被發現，印度大陸是OXA-181(第二大最常見的OXA-48衍生物)的主要來源之一。另有研究在阿根廷發現了一種不同的OXA-48同功酶OXA-163，它的不同之處在于一個單一的氨基酸取代和四個氨基酸缺失[26]。這種變體表現出特殊的水解特性，對廣譜頭孢菌素水解活性強，對碳青霉烯類抗生素的活性較弱。

碳青霉烯酶具有不同的水解活性，MBLs和KPC酶比OXA-48類酶更有效地水解碳青霉烯。然而，在具有碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌分離株中，無論產生哪種碳青霉烯酶，高水平的碳青霉烯耐藥性都需要額外的通透性缺陷[20]。相反，已鑒定出肺炎克雷伯菌的分離物，其所有類型的碳青霉烯酶均顯示出較低的碳青霉烯MIC。肺炎克雷伯菌與碳青霉烯酶的最初傳播可能是由于分離株的碳青霉烯MIC較低，且無通透性改變[27]。

3 遺傳背景

近年來，許多國家都報道了CRKP基于多位點序列分型(MLST)的分子流行病學數據顯示肺炎克雷伯菌ST型多種多樣[3]。各種報道表明ST型與菌株的耐藥性有關。例如，肺炎克雷伯菌ST258型是美國和希臘最常見的碳青霉烯類耐藥ST型[4,5]，ST340型與產生NDM-1碳青霉烯的肺炎克雷伯菌有關[6]。在全球范圍內，最常見的CRKP 菌株是 ST11 和 ST258，碳青霉烯酶基因通過流行的致病菌株進行克隆擴增而在世界范圍內傳播[28]。大多數國家(包括美國和歐洲國家)產KPC 的肺炎克雷伯菌的傳播主要是由單一優勢菌株 ST258 的擴增引起的[29]。ST258克隆仍然是產KPC肺炎克雷伯菌主要克隆型，占產KPC的80%[30]。ST258是由ST11和ST442之間的雜交克隆，80% 的基因組來源于 ST11 樣菌株，20% 來源于 ST442 樣菌株[31]。尚不清楚為什么ST258 譜系是產生 KPC 的克雷伯菌屬最普遍的克隆，ST258 克隆對動物模型中對血清殺傷高度敏感，并且缺乏肺炎克雷伯菌毒力因子，如產氣桿菌素基因、K1、K2 和 K5 莢膜抗原基因，以及粘液表型基因rmpA的調節因子[32]。

有研究顯示，ST258 菌株由兩個不同的遺傳分支組成(cps-1和cps-2 )，兩者間的遺傳分化源于約215 kb 的分歧區域，其中包括參與莢膜多糖合成的cps基因，多重 PCR檢測了肺炎克雷伯菌ST258菌株中兩種莢膜類型，表明cps類型和 KPC 變異之間有顯著關聯：cps-1分支主要與 KPC-2 相關，而cps-2分支主要與KPC-3有關[33]。由于莢膜多糖可以助肺炎克雷伯菌逃避吞噬作用，該菌株的全球流行可能與莢膜多糖生物合成區域cps-1和cps-2有關。另有研究表明，整合共軛元件 ICEKp258.2 與 ST258 間的關系，ICEKp258.2 包含兩個特定的基因簇，一個 Ⅳ型菌毛基因簇(即pilV)，與質粒的攝取和交換及對活體和非活體表面的粘附相關，另一個Ⅲ型限制修飾系統的基因簇，該基因簇確定某些相容質?；蛞苿釉粨Q中的宿主特異性[34]。由于這些與質粒和特定移動元件限制相關的基因僅存在于 ST258 和基因相關序列類型中，這種差異可能解釋 ST258 主要攜帶 KPC 和 ST11 的差異，ST11 是另一個缺乏 ICEKp258.2 的高風險克隆，攜帶廣泛的質粒和碳青霉烯酶，包括 KPC、NDM、OXA-48、VIM 和 IMP[11]。盡管 ST258 菌株的 ICEKp258.2 型在全球范圍內流行，但 ST258 菌株在產生 KPC 的肺炎克雷伯菌中占優勢的確切原因仍未完全了解。ST11、ST14、ST101、ST147 和 ST258 是主要的產碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌克隆，ST258 主要在產 KPC 的肺炎克雷伯菌中發現，而其他克隆型則在各種產碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌中發現。

4 小結與展望

碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌(CRKP)對所有年齡段的患者構成越來越大的威脅，并且引起的感染也越來越受到重視，臨床治療面臨新的困境，而無論碳青霉烯酶是哪種類型，均需要精心設計大型隨機對照試驗和其他干預評估的流行病學研究和監測，通過分子特征鑒定來及早認識這些肺炎克雷伯菌克隆的傳播動態、風險因素和宿主，將對 CRKP 監測、感染預防、制定有效的治療方案和遏制這些危險序列類型的傳播提供必要信息。