基于TLR4/NF-κB信號通路探討綠原酸對糖尿病腎病大鼠腎組織炎癥和凋亡的影響

張文靜,徐新禹

(1. 朝陽市中心醫院，遼寧 朝陽 122000;2. 四川大學華西臨床醫學院，四川 成都 610000)

糖尿病腎病是糖尿病嚴重的微血管并發癥之一，也是引起糖尿病患者死亡的重要原因之一。該病發病特點是腎小球血管受損、硬化，臨床以尿蛋白排泄量增加為主要特征，其治療主要是基于血壓和血糖的控制，尚無有效的治療策略[1-2]。目前研究認為，氧化應激、炎癥反應、糖脂代謝功能障礙、血流動力學異常及細胞凋亡等多種因素參與糖尿病腎病的發生和發展，其中腎組織的持續炎癥反應及高糖引起的腎組織細胞凋亡是糖尿病腎病發展的重要病理生理基礎[3-5]。因此，探究糖尿病腎病腎組織炎癥及細胞凋亡的發生機制，對于防治糖尿病腎病具有重要的臨床意義。綠原酸是一種中草藥提取物，主要存在于金銀花、山楂、杜仲和菊花等中藥中，已被證明具有顯著的抗炎、抗氧化、抗菌和免疫調節作用[6-7]。朱超等[8]報道，綠原酸可通過抑制內質網應激反應而減輕糖尿病氧化性腎損傷，對糖尿病腎病具有一定治療作用。本研究旨在觀察綠原酸對糖尿病腎病大鼠腎功能、腎組織炎癥和細胞凋亡的影響，并探討其可能作用機制，為尋找綠原酸治療糖尿病腎病的作用靶點提供實驗基礎。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 SPF級健康雄性SD大鼠60只， 8周齡，體重(220±30 )g，購自大連醫科大學，動物合格證號：SCXK(遼)2018-0003。在室溫(23±2)℃、相對濕度50%～70 %、自然光照環境中飼養。動物處置符合相關倫理要求。

1.2試劑 綠原酸(純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司)；鏈脲佐菌素[STZ，純度≥98 %，翌圣生物科技(上海)股份有限公司]；過碘酸-雪夫氏(PAS)染色試劑盒、HE染色試劑盒、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒、RIPA緩沖液、BCA蛋白檢測試劑盒(上海碧云天生物技術研究所)；大鼠血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、尿蛋白定量、空腹血糖(FPG)檢測試劑盒(南京建成生物科技有限公司)；白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)；兔抗B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、淋巴細胞瘤-2相關蛋白X(Bax)、Cleaved-caspase-3、Toll樣受體4(TLR4)、核轉錄因子-κB p65(NF-κB p65)、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)、IκBα、p-IκBα抗體和鼠抗β-肌動蛋白(β-actin)抗體、HRP標記的山羊抗兔IgG、HRP標記的山羊抗鼠IgG(美國Abcam公司)。

1.3實驗方法 60只大鼠飼養1周適應環境后，隨機分為正常組、模型組、綠原酸低劑量組、綠原酸中劑量組、綠原酸高劑量組、二甲雙胍組，每組10只。除正常組腹腔注射檸檬酸鈉緩沖液外，其他各組大鼠腹腔注射50 mg/kg STZ(檸檬酸鈉緩沖液稀釋)建立糖尿病模型，連續注射5 d，最后一次注射72 h后采用尾靜脈針刺取血的方法檢測大鼠FPG水平，FPG>11.1 mmol/L表示糖尿病模型建立成功。此后定期檢測大鼠FPG和24 h尿蛋白，持續出現蛋白尿的大鼠為糖尿病腎病造模成功。造模成功后第2天，綠原酸低、中、高劑量組大鼠分別灌胃30 mg/kg、60 mg/kg、120 mg/kg 的綠原酸，二甲雙胍組大鼠灌胃200 mg/kg的二甲雙胍，正常組和模型組大鼠灌胃同等劑量的生理鹽水，均1次/d，連續灌胃8周。

1.4檢測指標及方法

1.4.1腎功能指標和FPG水平 末次灌胃12 h后，收集大鼠24 h尿液用于檢測24 h 尿蛋白定量；采集大鼠眼球血，以3 000 r/min離心10min，分離血清，保存于-20 ℃冰箱，采用全自動生化分析儀檢測SCr和BUN水平，血糖儀檢測FPG。

1.4.2腎組織HE染色病理形態 采血結束后處死大鼠，取腎組織，用預冷的生理鹽水洗滌，將左腎置于4 %多聚甲醛中固定24 h，依次蒸餾水浸泡、石蠟包埋、二甲苯透明、梯度酒精脫水，制成5 μm厚度的石蠟切片，取石蠟切片進行脫蠟、水化，用蘇木精染色5 min，PBS洗滌后，在1%鹽酸酒精中分化，伊紅溶液中染色30 s，梯度酒精脫水，透明處理后，中性樹膠密封，在光學顯微鏡下觀察組織病理變化。

1.4.3腎組織PAS染色形態 取大鼠腎組織石蠟切片，二甲苯脫蠟、蒸餾水沖洗，1.5%高碘酸處理25 min，用蒸餾水反復洗滌，PAS染色30 min，流水沖洗至顯出紅色，蘇木素復染5 min，流水沖洗，脫水、透明、封片，在光學顯微鏡下觀察染色結果，PAS染色陽性顯示為紫紅色，細胞核呈藍色。

1.4.4血清炎癥因子水平 -20 ℃冰箱中取出各組大鼠血清，嚴格參照大鼠ELISA試劑盒說明書檢測血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.4.5腎組織細胞凋亡情況 取大鼠腎組織石蠟切片，常規脫蠟、脫水，按照試劑盒說明書進行TUNEL染色，光學顯微鏡下觀察細胞凋亡情況，凋亡細胞呈褐色，計算細胞凋亡指數(AI)。AI=凋亡細胞數目/細胞總數目×100%。

1.4.6腎組織中凋亡蛋白和TLR4/NF-κB信號通路相關蛋白表達情況 采用Western blot 法檢測：取-80 ℃保存的大鼠右腎組織，用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液裂解提取總蛋白質，使用BCA蛋白質測定試劑盒測定蛋白質濃度，取定量蛋白上樣至SDS-PAGE凝膠電泳上，分離后轉移至PVDF膜上，在室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h后，將膜與1∶1 000比例稀釋的一抗(TLR4、p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-IκBα、IκBα、Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase-3和β-actin)在4 ℃條件下孵育過夜，洗滌膜后，將膜與HRP結合的二抗在室溫下孵育2 h，使用增強的化學發光試劑顯影，以生物光譜凝膠成像系統分析圖像，β-actin作為內參蛋白對照條帶進行標準化目的蛋白。

2 結 果

2.1各組大鼠腎功能指標和FPG水平比較 模型組大鼠24 h 尿蛋白定量、SCr、BUN、FPG水平均明顯高于正常組(P均<0.05)；綠原酸各劑量組和二甲雙胍組大鼠24 h 尿蛋白定量、SCr、BUN、FPG水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，且綠原酸高劑量組、二甲雙胍組各指標水平均明顯低于綠原酸低劑量組和綠原酸中劑量組(P均<0.05)。見表1。

表1 正常組和糖尿病腎病各組大鼠腎功能指標和FPG比較

2.2各組大鼠腎組織病理形態學表現 HE染色和PAS染色顯示，正常組大鼠腎小球大小、形態正常，結構完整、清晰，腎小管上皮細胞排列規則，無細胞壞死及炎性細胞浸潤；模型組大鼠腎小球體積增大，基底膜擴張增厚，腎小管結構紊亂，發生空泡樣變性，存在較多炎性細胞浸潤；與模型組比較，綠原酸各劑量組和二甲雙胍組大鼠腎小球體積減小，腎小球基底膜增厚和腎小管空泡樣變性得到不同程度改善，炎性細胞浸潤減少，其中綠原酸高劑量組和二甲雙胍組大鼠腎組織病理改變更輕。見圖1。

圖1 正常組和糖尿病腎病各組大鼠腎組織病理形態學表現

2.3各組大鼠血清炎癥因子水平比較 模型組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明顯高于正常組(P均<0.05)；綠原酸各劑量組和二甲雙胍組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，且綠原酸高劑量組和二甲雙胍組各指標水平均明顯低于綠原酸低劑量組和綠原酸中劑量組(P均<0.05)。見表2。

2.4各組大鼠腎組織細胞凋亡情況 TUNEL染色顯示，模型組大鼠腎組織細胞出現凋亡，AI為(35.61±1.79)%，明顯高于正常組的(2.83±0.53)%(P<0.05)；綠原酸各劑量組和二甲雙胍組大鼠腎組織細胞凋亡減少，AI分別為(26.38±1.45)%、(19.47±1.26)%、(10.35±1.02)%、(8.47±0.78)%，均明顯低于模型組(P均<0.05)，且綠原酸高劑量組和二甲雙胍組大鼠腎組織細胞凋亡更少，AI均明顯低于綠原酸低劑量組和綠原酸中劑量組(P均<0.05)。見圖2。

圖2 正常組和糖尿病腎病各組大鼠腎組織細胞凋亡情況(TUNEL染色法，×400)

2.5各組大鼠腎組織凋亡蛋白與TLR4/NF-κB信號通路相關蛋白表達情況 與正常組比較，模型組大鼠腎組織中Bcl-2蛋白相對表達量明顯降低(P均<0.05)，Bax、Cleaved-caspase-3、TLR4蛋白相對表達量和p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα均明顯升高(P均<0.05)；與模型組比較，綠原酸各劑量組和二甲雙胍組大鼠腎組織中Bcl-2蛋白相對表達量均明顯升高(P均<0.05)，Bax、Cleaved-caspase-3、TLR4蛋白相對表達量和p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα均明顯降低(P均<0.05)；與綠原酸低劑量組和綠原酸中劑量組比較，綠原酸高劑量組和二甲雙胍組大鼠腎組織中Bcl-2蛋白相對表達量均更高(P均<0.05)，Bax、Cleaved-caspase-3、TLR4蛋白相對表達量和p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα均更低(P均<0.05)。見圖3和圖4。

圖3 正常組和糖尿病腎病各組大鼠腎組織中凋亡蛋白表達情況

圖4 正常組和糖尿病腎病各組大鼠腎組織TLR4/ NF-κB信號通路相關蛋白表達情況

3 討 論

糖尿病腎病是全球慢性腎病的主要原因，目前臨床上尚無治療該病的有效藥物。近年來，隨著中醫藥現代化的快速發展，中醫藥辨證療法逐漸應用于糖尿病腎病的治療，并被證實具有良好的療效[9]。綠原酸是一種由咖啡酸與奎尼酸形成的苯丙素類物質，屬于多種中草藥的主要有效成分之一，其具有抗氧化、抗凋亡、降糖、降脂、心血管保護等多種生物學效應[10]。Bhandarkar等[11]研究表明綠原酸可減輕大鼠高碳水化合物、高脂肪飲食引起的心血管、肝臟和代謝變化。Liu等[12]研究發現綠原酸能夠通過調控氧化應激相關Nrf2通路對腦缺血/再灌注損傷大鼠發揮保護作用。Gao等[13]研究認為綠原酸可通過調節MAPK/ERK/JNK途徑改善右旋糖酐鈉誘導的小鼠潰瘍性結腸炎。Kong等[14]研究發現綠原酸可通過Sirt1介導的氧化還原和線粒體功能抑制百草枯誘導的細胞凋亡。本實驗采用腹腔注射STZ的方法建立糖尿病腎病大鼠模型，結果顯示模型組大鼠FPG水平顯著升高，腎功能顯著下降，腎臟組織存在明顯的損傷和炎性細胞浸潤；綠原酸各劑量組和二甲雙胍組大鼠FPG水平顯著降低，腎功能和腎組織損傷明顯改善，且綠原酸干預效果隨劑量增加而增強。提示綠原酸對糖尿病腎病具有一定的緩解作用，這與其他學者的研究結果相印證[15-16]。

高糖介導的腎臟慢性炎癥反應是糖尿病腎病發病機制的重要組成部分，糖尿病腎病發生、發展過程中過度表達的炎癥因子也是促進腎纖維化、導致腎衰竭的主要因素[17]。多項研究報道，IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子在糖尿病腎病大鼠腎臟中表達增加，而下調上述炎性因子的表達可減輕糖尿病腎病大鼠的炎癥反應[18-19]。本實驗結果顯示，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著升高，綠原酸各劑量組和二甲雙胍組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著降低。該結果與Bao等[20]研究結果一致，提示綠原酸可通過降低IL-1β、IL-6、TNF-α水平抑制糖尿病腎病大鼠炎癥反應。

細胞凋亡是細胞在分化和發育過程中由多種基因調控發生的自發性死亡方式，能被各種病理因素觸發。在糖尿病腎病中，高血糖引發的腎細胞凋亡是糖尿病腎病的主要病理特征，腎細胞凋亡進一步引起腎小管間質纖維化和腎小球硬化[21]。Yi等[22]報道，綠原酸可通過抑制凋亡蛋白Caspase-3蛋白表達及Bax/Bcl-2蛋白的比值抑制玉米赤霉烯酮誘導的卵巢顆粒細胞凋亡。本實驗中，綠原酸各劑量組和二甲雙胍組大鼠腎組織細胞凋亡及腎組織中Bax和Cleaved-caspase-3蛋白表達較模型組明顯減少，腎組織中Bcl-2蛋白表達較模型組明顯增加，表明綠原酸可通過調控凋亡蛋白表達而抑制腎細胞凋亡。

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是天然免疫系統中一類保守的模式識別受體，在外界病原體刺激下可激活下游炎癥信號通路。TLR4是TLRs家族中的重要成員，在炎癥反應發生過程中起著關鍵性作用。NF-κB作為TLR4信號通路的下游效應因子，在正常生理條件下以無活性的NF-κB p65和p50等構成的異源二聚體與抑制性蛋白IκBα結合，而在病理條件下，IκB激酶能夠使IκBα特異磷酸化，促使NF-κB p65轉移至細胞核中，導致機體釋放炎癥因子而引發炎癥反應。有研究報道，TLR4/NF-κB信號通路在急性腎損傷、慢性腎臟疾病中發揮重要作用[23-24]。Ye等[25]研究提示，綠原酸能夠通過抑制TLR4/NF-κB通路減輕脂多糖誘導的急性腎損傷。本實驗結果顯示，綠原酸和二甲雙胍可有效下調糖尿病腎病大鼠腎組織中TLR4蛋白表達，抑制NF-κB p65和IκBα磷酸化。提示綠原酸可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路保護糖尿病腎病大鼠腎功能。

綜上所述，綠原酸可通過減輕腎組織炎癥和調控凋亡蛋白表達而抑制腎細胞凋亡，保護糖尿病腎病大鼠腎功能，其內在機制可能與調控TLR4/NF-κB信號通路有關，為綠原酸治療糖尿病腎病提供了新的潛在靶點。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。