乙醇強還原土壤滅菌法對番茄連作土壤微生物和理化指標的影響

王英磊，王策，劉耀臣，孫豐寶，李敏

(1.煙臺市農業技術推廣中心，山東煙臺 264000; 2.青島農業大學園藝學院，山東青島 266109)

連作障礙已成為制約我國設施蔬菜生產的嚴重問題，土傳病害是造成蔬菜連作障礙的最重要因素，嚴重制約了蔬菜產業的發展。防治土傳病害常采用的高溫悶棚等物理防治措施對溫度要求苛刻[1]；藥物熏蒸等化學防治措施存在食品與環境安全問題[2]；微生物菌劑等生物防治措施成本較高且效果不穩定，因此，尋求新的綠色土壤滅菌方法十分必要。日本、荷蘭科學工作者[3-4]受水稻輪作種植的啟發，在21世紀初提出了一種強還原土壤滅菌法(reductive soil disinfestation, RSD)，也稱生物土壤滅菌法(biological soil disinfestation, BSD)。Momma等[5]利用麥麩發酵后所產生的乙醇成分進行土壤消毒，發現乙醇能起到消滅菌蟲的作用；而后進一步確定低濃度乙醇可以起到土壤消毒的作用，消毒功效與傳統化學方法相當[6]，并發現土壤微生物參與消毒過程，于是在日本全國范圍內開展了利用低濃度乙醇作為碳源的強還原土壤消毒工作[7]。我國學者向土壤中施加不同種類、不同比例的有機物料，發現RSD法可以顯著抑制土壤病原菌[8-9]。施加固體有機物料可以顯著抑制土壤病原物，但相較于液體物料，固體物料需要借助機械施加且不易被施加到深層土壤中[5]。施用低濃度乙醇進行土壤滅菌可以顯著抑制再植蘋果樹病原物[10]、番茄尖孢鐮刀菌[5]和草莓大麗輪枝菌[11]。

本研究基于RSD法的特點，針對我國設施蔬菜傳統的栽培模式，以綠色無害化防控設施蔬菜土傳病蟲害為目標，探究低濃度乙醇強還原土壤滅菌法(Et-RSD)對土壤微生物群落結構的影響，以期為實現減肥、減藥、增效，無害化防控設施蔬菜土傳病害提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

供試土壤取自山東省海陽市趙疃鎮東村莊(36°44′N，120°55′E) 連作5年番茄的日光溫室。采用五點取樣法取樣，剔除雜物后運回實驗室備用。土壤基礎理化性質如下：全氮含量1.3 g·kg-1，堿解氮含量150 mg·kg-1，全磷含量4.2 g·kg-1，速效磷含量114 mg·kg-1，全鉀含量26 g·kg-1，速效鉀含量263 mg·kg-1，pH值6.51，土壤電導率(EC)值 487 μS·cm-1。

1.2 試驗設計

試驗在恒溫培養箱中進行。取連作土壤，揀除大石塊和根系等雜物，過篩，晾干后裝入20 cm ×30 cm的透明密封袋內，每袋裝入連作土壤1 kg。每袋分別加入不同濃度(0、0.5%、1%、2%、4%)的乙醇溶液(乙醇濃度均為體積分數，0為純凈水，即對照)150 mL混合均勻，密封，放置于恒溫恒濕培養箱，黑暗培養，恒溫30 ℃。分別于10 d、15 d、20 d分批取出測定各項指標。共15個處理，每個處理設置3次重復。

1.3 試驗方法

1.3.1 微生物及線蟲培養和計數

真菌采用PDA培養基培養；細菌采用NA培養基培養；放線菌采用高氏1號培養基培養；尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)采用傳統平板培養法，用尖孢鐮刀菌專性培養基分離培養[12]；疫霉菌(Phytophthora)采用選擇性培養基分離培養[13]。

微生物數量均采用平板稀釋計數法[14]。土壤中線蟲的分離和計數：采用淘洗-過篩法和過篩-貝曼漏斗法對混合土樣中的孢囊和二齡幼蟲進行定量分離，在解剖鏡下對孢囊和殺死固定的二齡幼蟲進行觀察并計數[15]。

1.3.2 土壤理化指標測定

參照魯如坤[16]的方法：MP523-01型pH計(上海三信)按水土質量比2∶1測定土壤pH值；采用DDS-307型電導儀(上海儀電科學儀器股份有限公司)按水土質量比2∶1測定土壤EC值；用1260 Infinity 高效液相色譜儀(Agilent，德國)測定土壤乙酸含量。土壤氧化還原電位采用FJA-6氧化還原電位儀(南京傳滴儀器設備有限公司)測定。

1.4 數據分析

運用DPS v7.05軟件將數據進行整合分析，用LSD法進行多重比較分析，顯著水平P<0.05，圖表采用Microsoft Excel 2019制作。

2 結果與分析

2.1 不同濃度乙醇和處理時間對番茄連作土壤微生物數量的影響

當相同乙醇濃度處理下，隨著處理時間的延長，連作番茄土壤可培養真菌的數量逐漸降低(圖1A)，可培養細菌(圖1B)和可培養放線菌(圖1C)數量逐漸升高。當處理10 d時，1%處理土壤可培養真菌數量顯著低于對照，其余濃度與對照差異不顯著；處理時間為15 d和20 d的趨勢相同，2%和4%乙醇處理的可培養真菌數量顯著低于對照，4%乙醇處理20 d的土壤中可培養真菌數量最低，與2%乙醇處理20 d差異不顯著，二者分別比 10 d對照處理降低了59.8%和56.0%。

當處理10 d時，除0.5%乙醇外，其他濃度處理細菌數量顯著高于對照；處理15 d和20 d的土壤細菌數量與10 d的趨勢相似，其中4%乙醇處理20 d的土壤中可培養細菌數量最高，且與2%濃度處理20 d和4%乙醇處理15 d差異不顯著，三者分別比10 d對照處理增加了380.4%、328.6%和276.8%。

當處理10 d時，隨乙醇濃度的增加，放線菌數量逐漸增加，且2%和4 %乙醇放線菌數量顯著高于對照；處理15 d和20 d的土壤放線菌數量與10 d的趨勢相同，其中4%乙醇處理15 d的土壤中放線菌數量最高，比10 d對照處理增加了618.2%。

以上結果表明低濃度乙醇強還原處理可以減少土壤中真菌的數量，增加土壤中細菌和放線菌的數量。

圖1 不同濃度乙醇和不同處理時間對番茄連作土壤微生物數量的影響

2.2 不同濃度乙醇和處理時間對番茄連作土壤病原菌數量的影響

除對照外，當相同乙醇濃度處理時，隨著處理時間的延長，番茄連作土壤中尖孢鐮刀菌(圖2A)和疫霉菌(圖2B)數量逐漸降低。當處理時間相同時，隨著乙醇濃度的增大，尖孢鐮刀菌和疫霉菌數量逐漸降低；4%乙醇處理20 d的病原菌數量最低，二者分別比10 d對照處理降低87.5%和92.0%，2%乙醇處理20 d和4%乙醇處理15 d差異不顯著。表明低濃度乙醇強還原處理可以減少土壤中尖孢鐮刀菌和疫霉菌數量。

圖2 不同濃度乙醇和處理時間對番茄連作土壤尖孢鐮刀菌和疫霉菌數量的影響

2.3 不同濃度乙醇和處理時間對番茄連作土壤根結線蟲繁殖體數量的影響

當處理時間相同時，隨著乙醇濃度的增大，連作番茄土壤中根結線蟲二齡幼蟲(圖3A)和卵囊(圖3B)數量呈下降趨勢；相同濃度條件下，隨處理時間的增加，土壤二齡幼蟲和卵囊數量逐漸下降。不同處理時間下，乙醇處理的土壤中二齡幼蟲和卵囊數量都顯著低于對照，其中4%乙醇處理的土壤中二齡幼蟲和卵囊數量最低。處理時間為20 d時，4%乙醇處理的土壤中二齡幼蟲和卵囊數量最低，且與2%乙醇處理差異不顯著，兩個處理濃度下二齡幼蟲數分別比10 d對照處理降低86%和79.8%，卵囊數分別降低75.6%和85.0%。表明低濃度乙醇強還原處理可以顯著減少土壤中的根結線蟲二齡幼蟲和卵囊數量。

圖3 不同濃度乙醇和處理時間對番茄連作土壤根結線蟲二齡幼蟲和卵囊數量的影響

2.4 不同乙醇濃度和處理時間對番茄連作土壤可培養微生物比例的影響

由表1可知，低濃度乙醇處理以后番茄連作土壤細菌/真菌(B/F)、放線菌/真菌(A/F)數量比在相同處理時間下，隨著乙醇濃度的升高逐漸升高。處理時間為10 d時，4%乙醇處理B/F顯著高于對照和0.5%處理，但與1%和2%乙醇間差異不顯著；4%乙醇處理A/F與2%處理間差異不顯著，但顯著高于其他濃度處理。當處理時間為15 d時，4%乙醇處理的B/F和A/F顯著高于其他處理，其他處理間的B/F和A/F均不存在顯著差異。當處理時間為20 d時，2%和4%乙醇處理的B/F顯著高于其他處理；1%、2%和4%乙醇處理A/F顯著高于對照和0.5%處理。其中4%乙醇處理15 d和20 d及2%乙醇處理20 d三個處理B/F和A/F顯著高于其他處理。說明乙醇強還原處理可以將土壤從“真菌型”土壤轉變為“細菌型”土壤。

表1 不同濃度乙醇和不同處理時間對番茄連作土壤微生物結構的影響

2.5 不同濃度乙醇和處理時間對番茄連作土壤理化性質的影響

低濃度乙醇強還原處理對土壤pH、EC等理化指標有一定影響(表2)，在相同處理濃度下，隨時間的增加，pH先降低再升高；當處理20 d時，4%乙醇處理的pH顯著高于對照。相同處理時間內，不同濃度乙醇處理均能有效降低土壤電導率，4%乙醇處理20 d以后土壤電導率為162 μS·cm-1。在相同處理濃度下，隨著處理時間增加，低濃度乙醇處理土壤氧化還原電位顯著降低；相同處理時間內乙醇處理土壤氧化還原電位顯著低于對照。隨處理時間和乙醇濃度的增加，土壤中乙酸含量均有不同程度提高(表2)。

表2 不同濃度乙醇和不同處理時間對番茄連作土壤某些理化指標的影響

3 討論

已有研究表明[4,7]，RSD法的滅菌機理可能與厭氧狀態、有毒有機酸、還原性產物以及土壤微生物群落結構的改變有關。本試驗中，隨著乙醇濃度和處理時間的增加，土壤pH先降低后升高，氧化還原電位逐漸降低，乙酸含量逐漸增加。這是由于在厭氧條件下長時間的土壤強還原過程中產生大量OH-可以中和酸性土壤，調節土壤pH值，使土壤pH值升高，氧化還原電位降低[17-18]，乙醇在土壤厭氧微生物的作用下發生氧化還原反應轉變成乙酸[19-20]。研究表明，強還原過程中產生的某些有機酸，如乙酸和丁酸對鐮刀菌具有很強的抑制作用[21-22]，本試驗中尖孢鐮刀菌數量顯著下降，且乙醇濃度越高尖孢鐮刀菌數量下降速度越快，可能與乙醇形成的有機酸相關。

土壤微生物群落結構對土壤理化性質和植物生長至關重要，是衡量土壤微生物多樣性和肥力的一個重要指標[23]。RSD處理對番茄根際土壤細菌群落組成影響較大[24], 土壤微生物中細菌和放線菌多為促進植物生長的有益菌，如芽孢桿菌和假單胞菌等[25-26]，而植物病害則多是由真菌引起的[27]。本試驗表明，隨著乙醇濃度和處理時間的增加土壤微生物群落結構發生了一定程度的改變，細菌和放線菌數量增加，真菌數量減少，逐漸向“細菌型”土壤轉變，且土壤中的尖孢鐮刀菌、疫霉菌和根結線蟲數量均顯著降低。這是因為強還原處理過程產生的有益菌利用易降解有機碳源大量繁殖，這些有益微生物的拮抗作用、競爭作用及寄生作用能較好地抑制病原菌[8,20,28]。Blok等[4]指出采用固體有機物料的RSD法操作煩瑣，Momma等[5]人研究表明低濃度乙醇進行土壤滅菌與有機物料滅菌效果相當。本試驗表明2%～4%乙醇溶液處理15～20 d對番茄連作土壤病原物鐮刀菌、疫霉菌和根結線蟲的抑制作用顯著，而2%乙醇處理成本低，因此認為2%乙醇溶液處理20 d為最佳組合。