Dhori病毒核蛋白抗原表位的篩選及鑒定

張 敏,古麗娜孜·沙都漢，劉利平，王 嵐，孫素榮，張渝疆，丁軍濤

蜱蟲是一種可寄生于人和動物體表、以吸食其血液為生的節肢動物，是病原體(寄生蟲、細菌和病毒等)最常見和最重要的載體之一[1]，在傳播疾病方面的危害僅次于蚊蟲，嚴重威脅人類和牲畜的健康[2]。蜱蟲可分為硬蜱科(Ixodidae)、軟蜱科(Argasidae)和納蜱科(Nuttalliellidae)3個科[3]。中國目前記錄的蜱類有125種，其中硬蜱111種，軟蜱14種[4]。

蜱傳疾病(TBDs)是蟲媒傳播疾病的一個主要因素，在全球范圍內，蜱媒疾病病例不斷增加，其分布的地理范圍逐漸擴大[5]，蜱傳病毒(tick-born virus，TBV)造成的危害越來越嚴重。人感染TBV最可能的方式是在戶外活動時被感染的蜱蟲叮咬[6]，還有可能與食用生羊奶、酸奶、奶酪和黃油等各種奶制品有關[7]。目前全球范圍內引起人類疾病的TBV，按病毒種類劃分，主要有內羅病毒科(Nairoviridae)、白蛉病毒科(Phenuiviridae)、黃病毒科(Flaviviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)和呼腸孤病毒科(Reoviridae)5科14種病毒[8]。正粘病毒科包括5個屬，即流感病毒A、B、C三屬、傳染性鮭魚貧血癥病毒屬和索戈托病毒屬[9]。蜱傳索戈托病毒屬包括索戈托病毒(Thogoto virus，THOV)、多理病毒(Dhori virus, DHOV)和波旁病毒[10]。

2017年，我國首次從新疆古爾圖地區采集的草原革蜱(Dermacctornuttalli)樣本中分離并鑒定出Dhori virus的新病毒株，將其命名為Dhori virus 17-GRT169(DHOV-GRT169)[11]。該病毒不但可感染牛、羊和駱駝等大型家畜[12]，也可以通過無媒介的氣溶膠途徑引起人類感染[13]。DHOV對小鼠是致命的，可引起與人類感染H5N1型流感病毒的報告相似的全身病理變化[14]。DHOV為負鏈RNA病毒，其基因組有7個RNA片段[15]，其中1～6 片段的 ORFs 分別編碼RNA依賴性RNA聚合酶亞基PB2、PB1、PA，以及糖蛋白(GP)、核蛋白(NP)和基質蛋白(M)[16]。有研究表明，NP蛋白氨基酸序列非常保守[17]，為主要特異性抗原，NP分子至少包含3個獨立的抗原位點，是淋巴細胞識別的主要抗原區域，并且可用于正粘病毒科不同屬間的鑒別[18]，但目前關于DHOV NP功能方面的研究未見報道[13]。

B細胞表位的準確鑒定為抗體治療藥物、多肽疫苗和免疫診斷工具的開發奠定了基礎[19-20]。表位疫苗是在現代疫苗發展中出現的一種新型疫苗設計策略[21]。與聚合酶鏈式反應(PCR)、實時熒光定量PCR(qPCR)和原位雜交(ISH)等一些病毒性病原的檢測方法相比，血清抗體檢測更能快速、有效地反映感染者的感染狀態。

本研究對DHOV NP蛋白抗原表位進行鑒定，為DHOV的流行病學調查和疫苗研制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 抗Dhori病毒NP兔多克隆抗體、pGEX-6P-1質粒、原核表達質粒pXXGST-3為本實驗室保存；DHOV陽性羊血清由中國科學院武漢病毒研究所惠贈。限制性內切酶、DNA Marker DL5000、T4連接酶購自TaKaRa公司；E.coliBL21(DE3)、帶GST標簽鼠單克隆抗體、山羊抗小鼠IgG-HRP、山羊抗兔IgG-HRP購自北京索萊寶生物有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 DHOV NP二級結構分析及分段表達策略 利用Signal 4.1和TMHHMM生物信息學分析軟件對DHOV NP(GenBank登錄號：MH688512.1- MH688517.1)進行了信號肽和跨膜區的預測。同時利用DNAStar-Protean軟件對DHOV NP的二級結構進行分析，預測α螺旋、β轉角、無規卷曲結構等二級結構及其親水性、抗原性強的氨基酸序列；利用在線分析軟件預測B細胞可能的線性表位。結合上述結果綜合分析，初步確定NP的分段表達區域和潛在的抗原富集區。根據分析結果，將NP全長截短為A、B、C、D 4個片段(圖1)?；蚱斡缮虾＝萑鹕镉邢薰竞铣?。

圖1 DHOV NP蛋白分段表達策略Fig.1 Segmented expression strategy of DHOV NP protein

1.2.2 截短片段原核表達質粒的構建 利用EcoRⅠ、XhoⅠ限制性內切酶酶切pGEX-6P-1質粒，確認酶切成功后進行膠回收，將4個目的片段與pGEX-6P-1載體連接。分別構建pGEX-6P-1-A(1-112 aa)，pGEX-6P-1-B(109-222 aa)，pGEX-6P-1-C(219-336 aa)和pGEX-6P-1-D(333-460 aa)4個重組質粒。

1.2.3 截短片段的誘導表達及Western blotting抗原性分析 將重組質粒轉化至E.coliBL21(DE3)中，利用IPTG 誘導表達，SDS-PAGE驗證表達結果。將表達的蛋白濕轉至PVDF膜后置于5 %脫脂奶粉中4 ℃過夜封閉，次日加入抗DHOV-NP的兔多克隆抗體(1∶1 000)或抗GST鼠單克隆抗體(1∶3 000)于37 ℃中孵育1 h，將PVDF膜于TBS-T中充分洗滌后，分別加入HRP標記羊抗兔(1∶3 000)或HRP標記羊抗鼠二抗(1∶3 000)于37 ℃孵育30 min，TBS-T洗滌PVDF膜，加適量ECL后于化學發光成像儀中顯色。

1.2.4 截短16/8肽重組質粒的構建 采用改良生物合成肽法，將陽性的截短片段截短成相互重疊8個氨基酸的16肽，陽性的16肽繼續截短為相互重疊7個氨基酸的8肽。利用BamHⅠ、SalⅠ限制性內切酶對pXXGST-3質粒進行酶切，確認酶切成功后進行膠回收，將16/8肽基因片段連接至pXXGST-3后測序驗證。

1.2.5 DHOV NP截短16/8肽的誘導表達及Western blotting抗原性分析 將重組質粒轉化至E.coliBL21(DE3)中，利用IPTG 誘導表達，SDS-PAGE驗證表達結果。將表達的蛋白濕轉至PVDF膜后置于5 %脫脂奶粉中4 ℃過夜封閉，次日加入抗DHOV-NP的兔多克隆抗體(1∶1 000)或抗GST鼠單克隆抗體(1∶3 000)于37 ℃中孵育1 h，將PVDF膜于TBS-T中充分洗滌后，分別加入HRP標記羊抗兔(1∶3 000)或HRP標記羊抗鼠二抗(1∶3 000)于37 ℃孵育30 min，TBS-T洗滌PVDF膜，加適量ECL后于化學發光成像儀中顯色。

1.2.6 精細抗原表位的三維構象定位 Python 2.7軟件分析BCEs在DHOV NP蛋白三級結構上的定位。

2 結 果

2.1 DHOV NP生物信息學分析 經Signal 4.1和TMHHMM等分析軟件預測表明，NP氨基酸序列不含信號肽序列和跨膜區序列，蛋白位于膜外區。經DNAStar-Protean軟件對DHOV NP蛋白二級結構進行了預測(圖2)，分析了氨基酸序列的親水性，柔韌性，抗原性及表面可及性。

圖2 DHOV NP蛋白二級結構的生物信息學分析結果Fig.2 Results of bioinformatics analysis of the secondary structure of DHOV NP

2.2 重組質粒酶切鑒定 4個重組質粒經EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，分別在336 bp、342 bp、354 bp、384 bp處有目的條帶(圖3)，測序結果正確，重組質粒構建成功。

2.3 截短蛋白的誘導表達 SDS-PAGE電泳分析結果顯示，DHOV NP蛋白的4個截短蛋白的條帶大小與預期一致(圖4)，分別在38.3 kDa、38.5 kDa、38.9 kDa、40.0 kDa左右的位置有清晰的目的條帶，表明融合蛋白表達成功。

2.4 截短蛋白的抗原性分析 Western blotting 結果顯示，4個截短蛋白均能被兔抗DHOV NP多克隆抗體、鼠抗GST單克隆抗體識別，說明截短蛋白都具有良好的抗原性(圖5)。

M：DNA Marker DL5000；1-2：pGEX-6P-1-A酶切前后；3-4：pGEX-6P-1-B酶切前后；5-6：pGEX-6P-1-C酶切前后；7-8：pGEX-6P-1-D酶切前后。圖3 截短片段原核表達質粒的雙酶切鑒定。Fig.3 Identification of truncated prokaryotic expression plasmids by double digestion

M：蛋白Marker；1-2：pGEX-6P-1-DHOV-A/BL21誘導前后； 3-4：pGEX-6P-1-DHOV-B/BL21誘導前后；5-6：pGEX-6P-1-DHOV-C/BL21誘導前后；7-8：pGEX-6P-1-DHOV-D/BL21誘導前后。圖4 SDS-PAGE鑒定分段截短蛋白的誘導表達Fig.4 SDS-PAGE identification of induced expression of segmented truncated protein

A：抗GST鼠單克隆抗體；B：兔抗DHOV NP多克隆抗血清M：蛋白蛋白Marker；1-2：pGEX-6P-1-DHOV-A/BL21誘導前后；3-4：pGEX-6P-1-DHOV-B/BL21誘導前后；5-6：pGEX-6P-1-DHOV-C/BL21誘導前后；7-8：pGEX-6P-1-DHOV-D/BL21誘導前后。圖5 DHOV NP截短蛋白的Western blotting分析 Fig.5 Western blot analysis of segmented truncated DHOV NP

2.5 DHOV NP蛋白重疊16肽的誘導表達和Western blotting抗原性分析 SDS-PAGE電泳顯示55個重疊16肽均正確表達(圖6A和6C)，Western blotting結果顯示重疊16肽中的1(A1)、10(A10)、11(A11)、14(B1)、27(C1)、51(D11)、53(D13)能與兔多克隆抗體結合，具有抗原性(圖6B和6D)。

M：蛋白Marker；1～13：A1～ A13；14～26：B1～B13； 27～40：C1～C14； 41～55：D1～D15；NC：陰性對照(pXXGST-3表達的GST188蛋白)。圖6 NP蛋白55個重疊16肽SDS-PAGE(A、C)和Western blotting (B、D)分析Fig.6 The 55 overlapping 16mer peptides of NP protein were analyzed by SDS-PAGE (A, C) and Western blotting (B, D)

2.6 DHOV NP蛋白重疊8肽的誘導表達和Western blotting抗原性分析 SDS-PAGE電泳顯示重疊8肽均正確表達(圖7 A1-A7)；其中8肽A1-1、A1-2、A1-3、A1-6、A1-7；A10-9；A11-1和A11-2；B1-2和B1-3；C1-6和C1-9；D11-6和D11-9；D13-4被抗DHOV NP兔多克隆抗體特異識別,具有良好的抗原性(圖7 B1-B7)。通過最小表位序列作圖發現共鑒定出9個最小BCEs(圖7 C1-C7)。

2.7 DHOV NP蛋白抗原表位的三維構象分析 利用PymolTM軟件展示9個BCEs在NP蛋白三維結構上的定位。如圖8所有BCEs均位于NP蛋白三維結構表面，有利于與多克隆抗體結合。

3 討 論

DHOV屬于正粘病毒科索戈托病毒屬，可引起與人類感染H5N1型流感病毒的報告相似的全身病理變化[14]。有研究發現,DHOV在哥倫比亞省的人和羊體中流行，顯示DHOV已經威脅著人類和動物的健康，因此,有必要對該病毒做更深入的研究[22]。

A1-A7：SDS-PAGE電泳圖；B1-B7：Western blotting分析圖；C1-C7：8肽最小表位序列作圖M：蛋白Marker；NC：陰性對照(pXXGST-3表達的GST188蛋白)；PC：對應陽性16肽。圖7 NP截短8肽的表位鑒定分析Fig.7 Epitope identification and analysis of the truncated eight peptide of NP

圖8 BCEs在DHOV NP蛋白三維結構上的位點示意圖Fig.8 Epitope identification andanalysis of truncated 8mer peptides of NP protein

本課題組前期基于DHOV rNP為抗原的血清學檢測發現，在塔城地區烏蘇市古爾圖牧場和阿勒泰地區布爾津縣采集的羊血清中具有抗DHOV NP的抗體，說明該病毒在新疆地區有一定的流行，對該地區人獸具有潛在的風險。NP蛋白是多種病毒中含量最豐富、免疫原性最強的蛋白，是包裹病毒RNA基因組并形成螺旋狀核衣殼的內部蛋白[23]。NP蛋白參與病毒生活周期的多個階段，是一種高度保守的蛋白質，調節病毒的轉錄和復制，以及病毒特異性和毒性[24]，當宿主感染病毒時，細胞毒性T淋巴細胞(CTLs)識別NP為病毒蛋白的主要抗原[25]。由于NP全長蛋白氨基酸序列中，包含一些沒有抗原性的區域，因此去除這些可能具有干擾作用的表位區域，篩選具有較好抗原性的表位在準確診斷疾病方面有一定的重要性。目前國內外尚無有關 DHOV NP蛋白最小抗原表位鑒定或者多表位疫苗方面的研究報道。因此，深入研究 DHOV NP的免疫性質對于開發針對 DHOV 的檢測試劑和新型疫苗具有重要意義。

目前抗原表位的鑒定方法有肽掃描技術、生物肽合成法、X-ray衍射或核磁共振技術、質譜技術、氨基酸定點突變技術、噬菌體展示肽技術以及多種技術結合等[26]。多種現代生物和物理技術方法也被用來精確定位抗原和抗體直接相互作用中的氨基酸殘基或原子[27]。然而，這些方法也存在不足，即無法利用多克隆抗體(pAbs)來鑒定表位最小基序，因此對整個靶蛋白上的BCE進行鑒定有一定的難度[28]。本研究采用的“改良生物合成肽法”[29]，用于鑒定線性B細胞最小表位基序。在本課題組先前的表位相關的研究中，使用該策略鑒定了克里米亞-剛果出血熱病毒(CCHFV)NP、包膜糖蛋白Gn和Gc的線性B細胞表位，證明了改良生物合成肽法在表位鑒定相關研究中具有一定的可行性[30-31]。本實驗將4個陽性截短片段分為55個相互重疊8個氨基酸的16肽，免疫印跡法篩選出了識別兔抗DHOV NP多克隆抗體的7個具有抗原性的16肽。進一步將陽性片段分成62個相互重疊7個氨基酸的8肽，構建至pXXGST-3載體上，同樣利用兔多克隆抗血清鑒定了15個陽性8肽，因連續的8肽有重疊區域，最后鑒定出了9個最小抗原表位基序。已有的研究表明，最小抗原表位基序的長度通常為5至7個氨基酸或不超過20個氨基酸[32]。本研究鑒定出的9個表位的長度最短是由6個氨基酸殘基組成，最長是由8個氨基酸殘基組成(圖7)，這與已有的表位相關的研究結果一致[32]，因此，可能為后期多表位肽設計，多表位疫苗研發及預后提供理論數據。由于多表位肽在病毒的檢測方面受到越來越多的關注，對一些未知以及不易檢測的病毒蛋白的篩選工作越來越多。

本研究實驗結果有助于Dhori病毒的初期診斷、預防檢測和疾病治療，為Dhori病毒感染與免疫機制的闡明提供一定的理論基礎。同時，本研究只對DHOV核蛋白的精細抗原表位進行了鑒定，后續可選擇包膜糖蛋白進行抗原表位篩選，兩者結合設計多表位肽，以期提高對病毒的檢測率。

利益沖突：無

引用本文格式：張敏，古麗娜孜·沙都漢，劉利平，等. Dhori病毒核蛋白抗原表位的篩選及鑒定[J].中國人獸共患病學報，2022，38(11)：956-962. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.145