北京市肺結核病人耐藥篩查實施效果的研究

陳雙雙, 代小偉, 田麗麗, 楊新宇, 趙琰楓, 陳 昊, 易俊莉, 張紅偉, 王嫩寒, 李傳友, 丁北川

據世界衛生組織(World Health Organization，WHO)估算，2019年我國利福平耐藥結核病患者數為6.5萬例，占全球利福平耐藥患者數的14%，位居全球第2位[1]。耐多藥或利福平耐藥結核病(multidrug/rifampicin-resistant tuberculosis，MDR/RR-TB)傳播時間長、治愈率低、病死率高，給結核病控制帶來極大的挑戰[2]。近年來肺結核發病率位居北京市乙類傳染病的首位，是首都重點防治的重大傳染病，其中MDR/RR-TB的防治是我市乃至全國結核病控制的難點和重點問題。

根據《“十三五”全國結核病防治規劃》要求，為進一步提高耐藥肺結核患者的發現、治療和管理水平，北京市開展所有病原學陽性肺結核患者的耐藥篩查工作(具體篩查流程見圖1)。為了解2019年北京市耐藥結核病篩查方案實施以來的效果，及RR-TB患者對其他抗結核藥物的耐藥情況，以便進一步完善耐藥結核病的快速篩查流程，本文對2019年北京市結核病防治機構及定點醫院所有的結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)臨床分離株進行比例法藥物敏感性試驗，從而為今后耐藥結核病防治策略及治療方案提供理論基礎。

圖1 北京市利福平耐藥肺結核患者發現流程Fig.1 Identification process of patients with RR-TB in Beijing

1 材料與方法

1.1 資料來源 搜集北京市結核病防治機構及定點醫院2019年1月至12月可疑肺結核病患者臨床標本中分離的MTB 1 174株，進行3種抗結核藥物[利福平(RFP)、異煙肼(INH)、左氧氟沙星(LFX)]的比例法藥敏試驗，篩選出RFP耐藥株進行研究分析。采用回顧性研究的方法，分析RFP耐藥的86株MTB對應的86例RR-TB患者診療實踐過程中耐藥篩查Xpert試驗、Hain檢測及比例法藥敏試驗的執行情況。所有菌株均經抗酸染色及PNB/TCH方法鑒定為MTB，同一例患者有多個樣本時，只選取第1個樣本進行試驗及統計學分析。

根據中華人民共和國衛生行業標準 WS 196-2017[3]所有結核病患者，分為初治和復治。1)初治結核病患者：指初次發現肺結核且未接受抗結核藥物治療，或不規則抗結核治療療程<1個月的患者。2)復治患者：指不規則抗結核治療≥1個月，或初治失敗和復發的患者。3)按照《北京市耐藥結核病的快速篩查流程》所有肺結核疑似病人(包括Xpert陰性培養陽性病人)，均需進行RFP耐藥篩查, 本文中漏診率是指：按照本研究比例法藥敏試驗結果得到的利福平耐藥病人在臨床診療中未被判定為RFP耐藥的比例；漏篩率是指按照本研究比例法藥敏試驗結果得到的利福平耐藥病人在診療過程中未進行RFP耐藥篩查的比例。

1.2 儀器與試劑 GeneXpert技術反應盒及樣品試劑均購自美國Cepheid公司。GenoType MTBDRplus ver 1.0試劑盒及GT-Blot 48雜交儀均購自法國生物梅里埃公司。所有改良羅氏培養基均購自河南賽諾特生物技術有限公司。

1.3 基因Xpert檢測試驗 Xpert檢測參照產品說明書，將2 mL痰液根據標本性狀加入1～2倍體積前處理液消化后放入檢測試劑盒，由儀器2 h內自動報告是否檢出MTB，以及利福平是否耐藥。

1.4 線性探針MTBDRplus(簡稱Hain)檢測試驗 采用超聲裂解法提取陽性培養物中的MTB-DNA。取5 μL提取后的DNA加入45 μL擴增混合物，按照說明書的擴增程序進行擴增。擴增完成后取20 μL擴增產物進行雜交，雜交過程包括化學變性、雜交孵育、洗滌、偶聯和顯色等。根據顯色結果進行耐藥情況的判讀。判讀標準：27個反應條帶中，所有野生條帶均顯色且突變條帶無顯色時為敏感；野生條帶缺失不顯色或突變條帶顯色為耐藥。

1.5 比例法藥物敏感性試驗 參照《結核病實驗室檢驗規程》[4]培養陽性菌株均采用比例法進行藥敏試驗。藥物濃度分別為INH(0.20 μg/mL)，RFP(40 μg/mL)，LFX(2 μg/mL)，對照培養基為中性改良羅氏培養基。 耐藥百分比(%)=(含藥培養基上生長的菌落數/ 對照培養基上生長的菌落數)×100%。耐藥判定標準:若耐藥百分比≥1% 時判定為耐藥，<1%判定為敏感。

1.6 質量控制 每批藥敏試驗均利用標準株H37Rv進行質量控制。實驗室每年參加中國疾病預防控制中心結核病參比實驗室組織的藥敏試驗熟練度測試，成績均為優秀。

1.7 統計學分析 使用Excel 2016軟件進行數據收集和整理，SPSS 19．0軟件進行數據統計分析。計數資料采用率表示，組間采用χ2檢驗及Fisher確切概率法，P<0.05為差異有統計學意義；兩種檢驗方法的一致率=(觀察符合例數/觀察總例數)×100%。

2 結 果

2.1 培陽患者耐藥篩查基本情況 2019年1-12月北京市19家結核病定點醫療機構共分離MTB 1 174株，全部進行比例法藥敏試驗篩出利福平耐藥株為86株，利福平耐藥率為7.33%(86/1 174)，其中初治患者為80.23%(69/86)。耐多藥結核病(multidrug—resistant tuberculosis，MDR-TB)患者的分離株為64株，2019年北京市MTB耐多藥率為5.45%(64/1 174)。

比例法藥敏試驗中利福平耐藥株對應的86位患者Xpert試驗及結果如表1， Xpert陽性病例與表型藥敏試驗利福平耐藥檢出的一致率為88.57%(62/70)，初復治在4組Xpert試驗不同情況中差異無統計學意義(χ2=1.50，P>0.05)。

表1 Xpert試驗在表型耐藥RR-TB患者中的分布Tab.1 Distribution of Xpert test in patients with phenotype-resistant RR-TB

按照北京市耐藥篩查流程，16例MTB分離培養陽性且Xpert試驗結果為陰性或未進行Xpert試驗，應取分離培養的MTB菌株進行快速Hain試驗以補充篩查利福平耐藥情況，其中有3例患者進行了Hain試驗且結果為利福平耐藥，86例RR-TB中經Xpert和Hain兩種分子生物學方法快速篩查出65例，2例Xpert陰性和1例無Xpert結果后期培養陽性患者，取培養物進行了表型藥敏試驗，剩余10例未進行任何分子和表型方法的臨床藥敏篩查，漏篩率為11.63%(10/86)，詳情見表2。2019年全年經耐藥篩查工作發現RR-TB 68例，8例Xpert為利福平敏感而表型藥敏為利福平耐藥，以比例法藥敏試驗為金標準，通過耐藥篩查工作RR-TB患者發現率為79.07%(68/86)，其中分子生物學方法RR-TB患者發現率為75.58%(65/86)，漏診率為20.93%(18/86)。

表2 Xpert試驗陰性及未進行Xpert試驗的RR-TB中耐藥篩查情況Tab.2 Screening of drug resistance in RR-TB with negative Xpert test and without Xpert test

2.2 MTB耐藥性檢測結果分析 1 174株MTB中比例法藥敏檢測肼耐藥為144株，MDR為64株，異煙肼耐藥菌株中MDR為44.44%，RR中MDR為74.42%。RR耐藥株中MDR比例明顯高于異煙肼耐藥株，差異具有統計學意義(χ2=20.04，P<0.05)。

以表型藥敏結果為金標準，根據2021年WHO最新發布的準廣泛耐藥(pre-extensive drug resistance tuberculosis，pre-XDR-TB)的新定義，符合MDR/RR-TB外，同時對任意氟喹諾酮類藥品(包括左氧氟沙星、莫西沙星)耐藥。86株RR臨床分離株中LFX耐藥為20株，準廣泛耐藥率為1.70%(20/1174)，在RR-TB中準廣泛耐藥率為23.26%(20/86)。初復治在3種不同耐藥類型中差異無統計學意義(χ2=1.02，P>0.05)，見表3。

表3 不同耐藥類型的分布情況Tab.3 Distribution of different resistance types

3 討 論

北京市結核病防治機構及定點醫院2019年利福平耐藥株占全年MTB的7.33%，較2009年的9.5%[5]有所下降，遠低于吉林省的17.23%[6]，這與上海地區相似[7]，說明我市RR-TB耐藥狀況處于較低水平且逐步改善。這可能與我市2011年起對疑似耐多藥患者進行免費一二線抗結核藥物藥敏試驗，從而制定針對性的治療方案有關。

表型藥敏耐藥的86例RR-TB患者中，Xpert陽性檢出MTB為70例，其中利福平耐藥為62例，兩方法利福平耐藥檢出的一致率為88.57%，高于廣東地區報道的利福平耐藥株rpoB的突變率81.5%[8]，低于國內外眾多報道的90%～95%的突變率[9]。Xpert檢測直接使用原始臨床標本未分離培養，而分子生物學方法直接檢測臨床標本需耐藥MTB含量高于20%以上才能檢出[10-11]，而藥敏試驗為培養陽性的菌株，因此造成部分耐藥MTB的漏檢。本研究中有8例表型藥敏結果為耐藥而Xpert檢測為敏感。有研究表明，rpoB基因RRDR區外存在影響MTB對利福平耐藥的其他未知機制或者非ropB基因突變引起耐藥[12]。另外，異質性耐藥也是導致表型和基因型耐藥檢測結果不符的重要原因[13]。

按照北京市耐藥篩查流程，分離培養陽性且Xpert陰性或未進行Xpert試驗，應使用MTB菌株進行Hain試驗以補充篩查利福平耐藥情況，以便迅速獲得RFP的耐藥結果，盡快調整治療方案，仍有3例未選擇Hain試驗而直接進行比例法藥敏，由于表型藥敏耗時長，在一定程度延誤了耐藥治療方案的調整。另外10例分枝桿菌培養陽性未經過分子生物學耐藥檢測，漏篩率為11.63%。這提示我們各結防機構及定點醫院對耐藥結核病的重視程度不夠，仍有部分病原學陽性患者未獲得耐藥結果，工作落實層面存在問題。部分結核病防治機構及定點醫院對耐藥篩查流程熟悉程度不夠，貫徹執行力度不足，應繼續加強市區各結防機構耐藥篩查的督導與管理，從而進一步發揮Xpert聯合Hain方法的分子生物學耐藥檢測的優勢。

2019年通過耐藥篩查檢出RR-TB 68例，通過耐藥篩查工作RR-TB患者發現率為79.07%，遠高于同年我國RR-TB 28.7%的發現率[14]，但是仍然存在20.93%的漏診率。主要存在技術層面和工作落實層面兩方面的原因。首先，在技術方面存在著表型藥敏與分子生物學方法結果不一致現象，另外在耐藥篩查診療過程中工作機制有待完善，加強區縣市級診療人員對耐藥篩查重要性的認知，并定期開展督導檢查。

北京市耐藥篩查工作以Xpert方法為主的分子生物學快速耐藥檢測較傳統培養物藥敏試驗，對RR-TB診斷時間大幅縮短，報告時間的中位數分別為1.0(0.0～7.0) d和 62.5(34.0～94.3) d，大大提高了耐藥結核病的納入治療率[15-16]。其中通過Xpert試驗檢出RR-TB 62例，相比我市2018年以前僅對疑似耐多藥患者藥敏試驗篩查中RR-TB數量大大增加，其中初治患者占82.26%，說明耐藥MTB的傳播是本市RR-TB的重要來源[17]。因此在北京特大人口城市中，早期開展Xpert檢測，管理并治愈耐藥結核病人，從而盡早降低其傳染性是控制耐藥結核病的根本策略。

RR耐藥株中MDR占74.42%，異煙肼耐藥株中MDR為44.44%，稍低于WHO報道的新發耐利福平結核病中78%為耐多藥[1]。另外本研究顯示RR-TB、MDR-TB、pre-XDR-TB中初復治比例差異無統計學意義，說明無論初治復治患者一旦檢出利福平耐藥應高度懷疑耐多藥。因此建議臨床參考利福平檢測結果盡早開展主要抗結核藥物的藥敏試驗，同時通過診療專家組討論后確定診斷及治療方案，從而大大減低耐藥結核病的傳播風險。

本研究RR-TB中LFX耐藥株占23.26%，與魏淑貞等人報道的相似[18]，我國MDR/RR-TB患者對氟喹諾酮類藥品的耐藥率約25%，處于較高水平。氟喹諾酮類藥物在MDR/RR-TB治療中具有關鍵作用，現已作為利福平耐藥肺結核的核心藥物，若發生耐藥會大大降低治療效果，且影響短程和長程方案的選用[19]。若結果顯示氟喹諾酮類藥物敏感，優先采用短程化療方案；若結果顯示氟喹諾酮類藥物耐藥，則選用長療程化療方案治療，后續再結合傳統藥敏檢測結果調整化療方案。因此，按照《中國結核病預防控制工作技術規范(2020年版)》要求，對MDR/RR-TB在治療前應進行氟喹諾酮類藥物的分子藥敏檢測，以給出精準治療方案。MDR-TB治療方案中A組藥物貝達喹啉和利奈唑胺以及B組的氯法齊明較晚應用于結核病的治療，耐藥率較低，本研究對這3種藥物的耐藥性未涉及。

本研究存在一定的局限性。第一，本研究搜集的結防系統及定點醫院就診的患者以初治、病情稍輕、并發癥較少的患者為主，可能對所有肺結核患者的代表性有限。第二，本研究所進行的分子檢測及藥敏試驗，均沒有進行重復驗證，可能存在系統誤差。第三，由于本研究未開展MTB對貝達喹啉、利奈唑胺及氯法齊明藥物的表型藥敏試驗，對長療程MDR-TB的治療不能提供全面耐藥信息。第四，常用于治療肺結核的氟喹諾酮類藥物主要包括LFX及莫西沙星(MFX)，本研究未進行MFX藥敏試驗，可能實際pre-XDR-TB的發病數稍高于現統計數。

綜上所述，我市實施分子生物學方法為主的耐藥篩查以來，RR-TB的發現顯著增多，但仍有一定的漏篩率，應進一步加強管理和督促，以盡早降低MDR/RR-TB的傳染性。另外，我市應盡早開展氟喹諾酮類藥物的分子藥敏檢測，為耐藥結核病的治療提供精準的化療方案。

利益沖突：無

引用本文格式：陳雙雙, 代小偉, 田麗麗, 等. 北京市肺結核病人耐藥篩查實施效果的研究[J].中國人獸共患病學報，2022，38(11)：1018-1022. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.152