響應面法優化Fenton試劑脫色考馬斯亮藍G-250廢液

盧建發 ,鄧 彬 ,黃冰晴 ,張國廣 ,鄒金美*

（1.閩南師范大學生物科學與技術學院,福建漳州 363000；2.閩臺特色園林植物福建省高校重點實驗室,福建漳州 363000）

在蛋白質樣品定量測定的方法中，一種較為常用的方法是考馬斯亮藍G-250（G-250）測定法.其基本原理是：G-250 在游離狀態下呈現紅色，在酸性條件下，考馬斯亮藍G-250 與蛋白質的疏水區之間有親和力，結合后變為青色，故可用于蛋白質濃度的測定[1].G250測蛋白后的廢液存在色度大和pH 值低的特點，必須收集后做無害化處理.

H2O2和Fe2+發生Fenton 反應產生羥基自由基（OH·），OH·具有強氧化性，有催化染料脫色的能力，其催化有機物的反應，主要通過對-C-C-鍵發生脫氫處理或與-C=C-雙鍵發生加成反應，促使-C=C-雙鍵結構飽和或者-C=C-雙鍵斷裂降解為小分子物質，進而使染料分子降解脫色[2-3].另外Fenton 試劑中的Fe2+在反應中被氧化后形成的Fe3+具有絮凝生物大分子效果，對反應后的廢液進行離心、過濾或自然沉淀處理，能將絮凝物沉淀下來[4].有采用次氯酸鈉對G250廢液進行脫色的報道[5]，尚未見使用Fenton試劑對G-250廢液的褪色效果進行研究的報道.本文對該問題進行了探究，為實驗室中G-250廢液的處理提供參考.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

FeSO4（AR 級）、30%H2O2（AR 級）、NaOH（AR 級）、無水乙醇（AR 級）、考馬斯亮藍G-250（AR 級）、質量分數為85%磷酸（AR級）和高鐵酸鉀（AR級）等藥品購自國藥集團.

pH 計：梅特勒公司；電子天平TP-114：丹佛儀器公司；紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 考馬斯亮藍G-250廢液

G-250廢液是指對文獻[1]考馬斯亮藍結合法測定蛋白質濃度實驗項目開展中產生的廢液，經單獨收集，初步測定收集的G-250廢液的pH值在1.5～2之間.

1.2.2 單因素實驗

在預備實驗的基礎上，在20 mL G-250廢液的反應體系中分別考察三個單因素pH、H2O2投加量和Fe-SO4投加量，多個水平（pH=2、3、4、5、6，H2O2投加量30、40、50、60、70、80、90 μL，FeSO4投加濃度達到0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25 g/L）對G-250廢液脫色率的影響.操作步驟為：室溫下取G-250廢液加NaOH 調節廢液的pH 達到實驗設計pH 值，取20 mL 的符合實驗設計的不同pH 值的廢液于試管中，再依次加入設計的FeSO4和H2O2達到實驗設計要求（單因素實驗中3個因素的基本條件為pH=3，FeSO4投加濃度為2 g/L、H2O2投加量為30 μL），震蕩搖勻，室溫靜置30 min，6 000 r/min 離心5 min 取上清液，在595 nm處測定上清液的吸光值，分別測定脫色處理前后的吸光值，根據以下公式計算脫色率.

其中：A0為廢液處理前的吸光值；A為Fenton試劑處理后溶液的吸光值.

1.2.3 響應面實驗優化設計

以G-250廢液的脫色率作為響應值，運用響應面優化軟件（Design Expert 8.0），設計三因素三水平響應面優化實驗，實驗設計依據Βox-Βehnken原理，考察pH、FeSO4的投加濃度、H2O2投加量及各因素間交互作用對G-250廢液脫色率的影響[6]（表1）.以+1，0，-1分別代表自變量的高、中、低水平，共進行17個處理組實驗.

表1 響應面分析因素水平表Tab.1 Factors and levels of response surface methodology

1.3 Fenton試劑氧化脫色G-250分子的機理

紫外-可見光光譜：用紫外-可見光分光度計對Fenton試劑處理后的G-250廢液進行表征，掃描范圍為200～800 nm；取Fenton 試劑處理后的廢液10 mL，加入5%的高鐵酸鉀1 mL，混勻反應30 min 后離心收集上清液，掃描上清液200～800 nm 范圍的光譜.根據不同試劑處理前后的廢液的光譜變化推斷Fenton試劑導致G-250色素分子脫色的可能機理.

2 結果與分析

2.1 pH值對G-250廢液脫色效果的影響

結果表明pH值對G-250廢液脫色率有較大影響（圖1）.脫色率隨著pH值的增加呈現先增加再下降的趨勢，在pH=4時，脫色效果最好.可能是亞鐵離子在溶液中的存在形式和溶液的pH值存在很大關系，Fenton試劑在pH在3～5的溶劑中促進反應向產生羥自由基方向進行[6]，能產生足夠的羥基自由基來氧化降解G250廢液，在中性和堿性環境中，亞鐵離子催化H2O2產生羥基自由基的能力下降[7].后續脫色處理時，選擇pH=4.

圖1 pH值對Fenton 試劑脫色G-250廢液的影響Fig.1 Effect of pH on decolorization of G-250 waste solution by Fenton reagent

2.2 FeSO4濃度對G-250廢液脫色效果的影響

G250 廢液中投加不同濃度的FeSO4對廢液脫色率的影響見圖2.在FeSO4濃度小于1.5 g/L 的時候隨著FeSO4濃度的升高，G-250 廢液脫色率逐漸增加，濃度大于1.5 g/L 脫色率反而會下降.Fe2+是Fenton 反應中的催化劑，是產生羥基自由基的必要條件[8].當Fe2+過量時會導致H2O2分解速度加快，部分OH·尚未及時與有機物結合，就進行了副反應（H2O2+Fe2+→2OH·，2OH·→H2O2），會導致脫色率降低[9]，所以合適的FeSO4投加濃度是1.2～1.7 g/L.

圖2 FeSO4投加量對Fenton 試劑脫色G-250廢液的影響Fig.2 Effect of FeSO4 dosage on decolorization of G-250 waste solution by Fenton reagent

2.3 H2O2的投加量對G-250廢液脫色效果的影響

隨著H2O2投放量的增加，G-250 廢液脫色率先升高以后略微有所降低（圖3）.當H2O2的投加量為60 μL時廢液脫色效果最佳.當投加量大于60 μL時脫色率降低可能是過量的H2O2除可迅速氧化Fe2+成Fe3+，也會產生副反應（·HO+H2O2→HO2·+H2O2，HO2·+·HO→H2O+O2）[10]，副反應消耗·HO，使H2O2無效分解，脫色率降低.

圖3 H2O2投加量對Fenton試劑脫色G-250廢液的影響Fig.3 Effect of H2O2 dosage on decolorization of G-250 waste solution by Fenton reagent

2.4 考馬斯亮藍G-250廢液脫色率的響應面優化實驗結果

2.4.1 回歸模型的建立與分析

根據單因素實驗結果，分別選取三個單因素（A：pH；Β：投加的FeSO4濃度；C：H2O2投加量）的三個水平進行中心組合實驗，利用響應面法優化Fenton試劑對G-250廢液的脫色，設計并進行17次試驗，實驗設計方案及結果如表2所示，方差分析結果見表3.

表2 Βox-Βehnken 實驗設計與結果Tab.2 Design and results for Βox-Βehnken test

表3 回歸模型方差分析結果Tab.3 Variance analysis of regression model

利用Design-Expert 8.0 軟件對表3 數據進行二次多項式回歸擬合，得到回歸方程：Y=95.91-2.79A+1.19Β+3.83C+1.86AΒ+3.42AC+2.61ΒC-10.95A2-6.82Β2-9.27C2，由表3 可知，模型P＜0.000 1，說明預測值與試驗值存在相關性；失擬項P＞0.05，說明殘差由隨機誤差引起；結果表明此數學模型對Fenton 試劑脫色G-250 廢液效果的實際值與預測值之間具有很好的擬合度，該模型可以用于Fenton 試劑對G-250廢液的脫色率的分析、預測和確定脫色效果的最佳反應條件優化[6,11].由表3 中P值大小可以看出，3 個因素中對G-250廢液脫色率影響的大小順序為：H2O2投加量＞pH值＞FeSO4投加濃度.

2.4.2 G-250廢液脫色率響應面分析與優化

響應曲面是指當pH值、H2O2投加量、FeSO4投加濃度的其中一個因素取零點水平的時候，其他兩個因素的交互作用對G-250 廢液脫色率的影響情況（圖4 至圖6）.從圖4 和圖6 中可以看出H2O2投加量相較于pH 值、FeSO4溶液濃度的曲線陡峭，說明H2O2投加量對G-250 廢液脫色率的影響最大；圖4 和圖6 三維圖的投影即等高線呈現橢圓形，說明兩因素交互作用對脫色率影響顯著.響應曲面結果與回歸模型方差分析結果（表3）一致.

圖4 H2O2投加量與pH值交互作用的響應面Fig.4 Response surface of interaction between pH value of solution and H2O2 dosage

圖5 pH值與FeSO4投加量交互作用的響應面Fig.5 Response surface of interaction between pH value of solution and the concentration of FeSO4

圖6 FeSO4投加量與H2O2投加量交互作用的響應面Fig.6 Response surface of interaction between the concentration of FeSO4 and H2O2 dosage

2.4.3 最佳工藝的預測與驗證

使用Design Expert 8.0的優化功能，把脫色率的目標選項設定為最大值，運行軟件得到一個最優的理論方案，即：H2O2投加量為62.08 μL、FeSO4的濃度1.53 g/L、pH 值為3.91，此時的理論脫色率為96.49%.為方便實際操作：在20 mL G-250廢液中，選取H2O2投加量為60 μL，FeSO4投加濃度為1.5 g/L，pH值為4，進行了五次驗證試驗，測得G-250廢液平均脫色率為95.93%，與預測值間的相對差值為0.56%，表明用響應面法可以用于Fenton試劑對G-250廢液脫色的因素水平進行優化.

2.5 Fenton試劑使G-250褪色的化學機理

Fenton 試劑脫色G-250 廢液后光譜掃描結果表明在400～800 nm 的可見光區沒有光吸收（圖7），Fenton 試劑可以使G-250 廢液脫色，在紫外光區的240 nm 處有強吸收峰，表明處理后廢液中有共軛雙鍵存在，且應該是帶有苯環結構的分子[12]（圖7）.Fenton試劑脫色G-250后的廢液又加入高鐵酸鉀處理后，上清液掃描得到的光譜240 nm 處的光吸收峰消失（圖7），原因可能是強氧化劑高鐵酸鉀能夠氧化打開苯環結構，產物主要有順丁烯二酸、反丁烯二酸、草酸和甲酸等有機小分子[13-15]，苯環結構被破壞.結合G-250 自身結構特點和可能的降解點，推測Fenton試劑產生的OH·可以攻擊考馬斯亮藍G-250分子的某些共價鍵（圖8 紅色弧形箭頭所指）并使其斷裂，把G-250 分子降解成含苯環的游離小分子從而達到脫色目的（圖8），同時Fenton 反應中產生的Fe3+能產生絮凝效果使部分染料和蛋白質結合成的大分子物質絮凝沉淀[7]，從而達到較好的脫色效果.

圖7 Fenton試劑處理G-250后光譜圖及高鐵酸鉀處理后光譜Fig.7 Spectrogram of G-250 treated with Fenton reagent and potassium ferrate

圖8 Fenton試劑降解G-250分子后產物示意圖Fig.8 G-250 structure diagram and its possible degradation of chemical bonds

3 結論與討論

采用Fenton 試劑降解G-250 廢液，通過單因素試驗和響應面優化方法，優化了最優反應條件，確定在20 mL G250 廢液體系中，H2O2投加量60 μL，FeSO4 投加濃度為1.5 g/L，pH 值為4 時G-250 廢液脫色率可達到95.93%，條件優化結果可為考馬斯亮藍G-250廢液的脫色提供參考依據.

Fenton 氧化法中，H2O2投加量對脫色率的影響最大，可能是Fe2+存在的情況下，H2O2投加量的多少會直接影響羥基自由基生成的有效量，FeSO4有雙重作用，Fe2+可以充當催化劑提高反應效率，Fe2+被氧化后生成的Fe3+能夠產生絮凝效果，可以把結合蛋白質大分子的色素分子或游離的G-250 分子通過絮凝作用沉淀下來，脫色效果好.Fenton試劑氧化能力強、可產生絮凝沉淀、脫色反應快、藥劑簡單、成本低，是處理實驗室內G-250 廢液的良好方法.但其脫色后的廢液中仍然含有大量具有苯環分子結構的小分子化合物，其環境毒理效應還需要進一步探討.