FGF2的生物信息學分析及其在低氧神經保護中的作用研究*

曹曉宇，楊海霞，靳慶玲，謝 偉，2，邵 國，鮑牧蘭，2，巴德仁貴,2

(1.包頭醫學院內蒙古自治區低氧轉化醫學重點實驗室，內蒙古包頭 014040；2.包頭醫學院醫學技術與麻醉學院神經生物學教研室)

缺血/低氧是臨床醫學常見的基本病理過程和死因，也是航天、高原、深水等特殊環境所面臨的基本問題。缺血/低氧導致腦損傷的分子機制主要包括缺氧加重組織炎癥反應釋放細胞毒性物質來損傷腦組織及細胞能量代謝障礙加重腦組織細胞壞死，但內源性的防護機制可以提高細胞和組織對缺血/低氧的耐受[1]。缺血/低氧預適應(Ischemia/Hypoxia Preconditioning，I/HPC)是動員細胞和組織對缺血/低氧耐受的一種有效手段。I/HPC被認為是細胞內源性防護機制的啟動，這種防護機制一般通過預先給機體一個溫和的(亞致死性)缺血/低氧刺激，可以增強機體對隨后更嚴重的(致死性)缺血/低氧刺激的耐受力[2]。

成纖維生長因子(Fibroblast growth factor，FGF)是一種在神經系統中廣泛表達的促有絲分裂原，對中樞神經系統的生長、發育及損傷修復具有重要意義[3-5]。特別是在缺血/低氧刺激腦損傷后，內源性的FGF能夠刺激海馬神經前體神經母細胞分化，起到保護腦神經的作用[6,7]。通常FGFs以家族的形式存在，作為細胞間信號分子在胚胎發生和分化過程中發揮作用[8]。目前，在人體內鑒定出23個FGFs家族成員，其中FGF15尚未證實，多數FGFs(FGF3-8、10、15、17-19、21-23)的N末端具有典型的信號序列分泌蛋白。

有研究表明，癲癇或缺血性腦損傷后內源性FGF2對腦海馬組織的空間結構、語境記憶及神經元再生具有重要的作用，特別是腦損傷后內源性的FGF2的合成能夠刺激海馬神經前體神經母細胞分化，起到保護腦神經的作用[9,10]。同樣，Graham等研究發現，FGF2在幼年大鼠的學習與記憶功能發展過程中起促進作用，同時有助于成年個體恢復受損的認知功能[11]。雖然I/HPC及FGF均可以對組織產生保護作用，但是其確切的分子機制尚無定論，總體概括起來是降低能耗/增加供能和抑制死亡/促進生存，而這些保護性分子如何被調動和參與其中是個值得研究的問題。

1 材料與方法

1.1實驗材料 HT22細胞(小鼠海馬神經元細胞)(北京協和細胞中心)。

1.2數據處理及生物信息學分析

1.2.1數據的搜索與獲得 從MGI(Mouse Genome Informatics，http://www.informatics.jax.org)、UNIPROT (http://www.uniprot.org/)、NCBI (National Center for Biotechnology Information，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)等數據庫中搜索FGF基因家族成員，并利用UCSC genome browser 在線Blat分析軟件(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat)作為補充對比數據。為了保證序列比對的可靠性，分別選取了人(Homo sapiens)的FGF1(NP_000791.1，NM_000800.4 )和小鼠(Mus musculus)的FGF1(NP_034327.1，NM_010197.3)的序列作為標準查詢序列，利用SMART在線工具(http://smart.embl-heidelberg.de/)和CD-search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/ cdd/wrpsb.cgi)分析鑒定候選蛋白的FGF結構域。將鑒定出FGF2基因家族成員作后續生物信息學分析。

1.2.2FGFs基因家族成員的鑒定 從MGI、UNIPROT、NCBI三大數據庫中搜索FGF基因家族成員，以小鼠(Mus musculus)的FGF1(NP_034327.1，NM_010197.3)的氨基酸序列作為標準探針序列，同時建立本地BLAST文庫進行數據搜索作為補充數據。使用SMART和CD search在線工具分析鑒定候選蛋白的FGF結構域，利用MEGA6(http://www. megasoftware.net)軟件中的Clustal W程序對該蛋白家族的氨基酸殘基進行多序列聯配，其他參數為默認值。將比對序列結果使用鄰位相接法(Neighbor-Joining，NJ)進行系統發生樹的構建，其參數設置為：自舉法分析(bootstrap analysis)進行1 000次重復，代替模型(substitution model)為泊松分布，差異/缺失數據處理(gap/missing data treatment)為完全刪除等。分析進化樹每個節點上自舉值得期望值，同時使用最大簡約法(Maximum Parsimony，MP)作為優化方案并驗證NJ法構建的系統發生樹的可靠性。應用CLC Sequence Viewer 6.8軟件構建FGF家族蛋白序列比對。參數設置：序列分布(sequence layout)；Spacing設為10個氨基酸殘基；fixed wrap設為70氨基酸殘基，注釋分布選擇默認值，Residue Coloring設為含有背景顏色；Consensus設為選擇隱藏；Graph設為選擇隱藏，其他參數選擇默認值。

1.3建立HT22細胞低氧模型 經復蘇培養后選取狀態良好的細胞，分為空白對照組(C)、低氧組(H)及低氧預適應組(HPC)。設置低氧預適應組條件，低氧(1 % O2/5 % CO2/ 94 % N2)30 min和常氧(21 % O2/ 5 % CO2/ 75 % N2)30 min循環交替進行，共4個循環，后急性低氧13 h，復氧6 h；低氧組則為直接低氧刺激13 h，復氧6 h?？瞻讓φ战M不進行任何處理，完成模型后收集各組細胞。

1.4細胞中FGF2 mRNA的qRT-PCR檢測 使用Trizol提取法，按照說明書步驟提取各組細胞總RNA，使用Thermo反轉錄試劑盒，取3 μg總RNA用于cDNA第一鏈合成，對FGF2及β-actin基因進行qRT-PCR檢測。

1.5細胞中FGF2蛋白表達變化檢測 向細胞沉淀中加入100 μL RIPA裂解液和1 μL蛋白酶/磷酸酶抑制劑，振蕩混勻，4 ℃ 12 000 rpm離心15 min，收集上清液為蛋白懸液。使用Thermo BCA蛋白定量試劑盒，根據說明書測定每個樣品的蛋白濃度。在12 % SDS-PAGE凝膠上電泳分離蛋白后，將蛋白質轉印到PVDF膜上。將膜封閉在5%的脫脂牛奶中以35 rpm/min室溫封閉1.5 h，使用1×TBST洗膜10 min，共3次。使用抗FGF2一抗(1∶1000稀釋，Santa)，抗β-actin一抗(1∶1000稀釋，Santa)于4 ℃條件下孵育PVDF過夜，1×TBST洗膜3次，每次10 min。室溫下用辣根過氧化物酶標記的驢抗兔和山羊抗小鼠抗體孵育1.5 h，1×TBST洗膜10 min，共3次，然后使用ECL超敏發光液覆蓋在PVDF膜上，放入化學發光儀曝光，檢測抗體的表達。

1.6統計分析 所有實驗均重復三次或以上，實驗數據取各組平均值，使用SPSS軟件進行數據分析，以(均數±標準差)表示，使用單因素方差分析(ANOVA)來比較多組數據間差異，兩組間數據比較使用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1FGF家族系統進化樹構建及保守序列分析 系統進化樹法是一種親緣分支分類方法。為了研究家族基因之間的進化關系，采用MEGA6軟件中距離依靠法(distance methods)中的NJ方法對人源FGF1-FGF23和鼠源FGF1-FGF23基因構建系統進化樹(圖1)。分析結果表明，FGFs家族又分為7個亞家族(即：FGF1、FGF4、FGF7、FGF8、FGF9、FGF11、FGF15/19)，每個亞家族含有2～4個成員，FGF每個亞家族自舉法的期望值較高，人源和鼠源FGF基因在進化上同源性較高，聚為一類。其中FGF15/19亞家族中除了FGF22、FGF23分別對應并聚類在一個進化分支上，鼠源FGF15與人源FGF19聚類在一個進化分支上。

2.2FGF家族保守序列分析 以FGF蛋白為查詢序列，CD search在線工具分析鑒定FGF結構域，同時通過CLC Sequence Viewer 6.8軟件對序列進行比對，本文只列出具有典型FGF家族結構域的FGF1和FGF2進行系統分析(圖2)。FGF1含有一個由16個氨基酸組成的FGF受體結合域(Y-x31-S-x-E-x-A-x27-P-x7-E-x2-EENHYN-x-Y-x33-L-x-L-x-L)，而FGF2含有一個由17個氨基酸組成的FGF受體結合域(K-x2-Y-x31-Q-x-E-x-R-x27-V-x7-E-x2-ESNNYN-x-Y-x31-L-x- L-x-M)。雖然FGF家族典型結構域部分氨基酸不同，有多個保守的基序組成，但不同FGF家族成員能夠與特定的FGF受體結合進行信號的轉導。FGF家族成員含有肝素結合區域。肝素結合位點是由富含賴氨酸和精氨酸結構域(KK-K-R-K)組成，肝素與FGF-FGFR復合物的FGFR-1接觸，促進FGFR二聚化，通過調控FGF的活性進而調控信號轉導，促進細胞的增殖和分裂。

圖2 FGF蛋白保守結構域預測和序列比對

2.3低氧和低氧預適應對FGF2 mRNA表達水平的調控 基于生物信息學研究結果分析，結合前期實驗對FGF家族成員在大腦皮層和海馬區的表達譜分析，FGF2的功能研究具有重要意義，因此本研究通過細胞實驗進一步檢測FGF2在低氧及低氧預適應條件下的表達情況，進而探討其功能特點。結果如圖3所示，相比于C組，H組和HPC組FGF2 mRNA表達水平均有所下降(P<0.05)，而與H組相比，HPC組FGF2 mRNA表達水平有所升高(P<0.05)。結果顯示，低氧刺激和低氧預適應均降低了FGF2在mRNA水平的表達，而低氧預適應相比于低氧刺激FGF2 mRNA表達有所升高，表明低氧預適應的神經保護作用可能與FGF2的差異表達有關。

圖3 各組HT22細胞中FGF2 mRNA表達水平

2.4低氧和低氧預適應對FGF2蛋白表達水平的調控 結果如圖4所示，相比于C組，H組和HPC組FGF2蛋白水平表達均有所下降(P<0.05)，而與H組相比，HPC組FGF2蛋白水平表達有所升高(P<0.05)。結果顯示，低氧刺激和低氧預適應均降低FGF2在蛋白水平的表達，而低氧預適應相比于低氧刺激FGF2表達有所升高，表明FGF2可能參與低氧耐受神經保護作用。

圖4 各組FGF2蛋白表達水平

3 討論

提高神經細胞對缺氧的耐受性可減輕缺血/缺氧所引起的腦部疾病(如缺血性腦卒中)的癥狀[12,13]。低氧預適應作為機體的內源性保護機制，通過間斷性低氧刺激手段可以有效地預防這一疾病的發生。有研究表明，在這一保護過程中多種相關基因在mRNA以及蛋白水平均發生明顯的變化，進而影響機體的學習記憶能力[14-16]。

生物信息學方法與傳統的基于實驗室生物學研究相比，可以用較低的成本和較快的時間獲得研究線索。通過對家族蛋白的系統進化關系、理化性質、蛋白質功能域的預測和分析，發現新規律、新信息，為進一步的實驗研究提供思路和切入點[17-19]。

新生血管的生成對缺血性腦血管疾病的治療是目前國內外研究的熱點。FGF2是纖維細胞生長因子家族成員之一，是最早發現的血管生成因子之一，其在體內、體外具有促使細胞遷移和血管生成等作用[20,21]。缺血性卒中后，FGF2可能上調中樞神經系統周細胞中PDGFRβ的表達，通過與PDGF-BB的相互作用激活周細胞的功能，有助于神經保護和血管生成，表明FGF2是治療腦缺血的潛在靶基因[22]。此外，研究表明，敲除FGF2明顯增加小鼠腦梗死體積并且影響BDNF和NF-κB表達的水平，揭示內源性FGF2在缺血性腦損傷中具有重要的神經保護作用[23]。本研究探索FGF2是否參與低氧耐受神經保護過程。本研究提取了各組小鼠海馬神經元細胞(HT22)中的總蛋白和RNA，通過WB和qPCR的方法檢測FGF2的表達變化。研究發現，相比于對照組，低氧與低氧預適應處理均下調了FGF2表達，但低氧預適應組相比于低氧組，FGF2的表達有所上調，揭示低氧預適應作為細胞內源性防護機制的啟動，通過觸發多種機制來誘導其神經保護作用，例如增強血管調節，通過上調與血管生成相關基因的表達(如FGF2的表達)，以此增強機體對之后更嚴重的低氧/缺血刺激的耐受性。雖然本研究表明FGF2可能參與低氧預適應的神經保護作用，但FGF及其家族成員的種類及功能十分復雜，因此FGF2參與神經保護的相關信號通路還需要深入探索。本研究旨在為缺血/低氧相關疾病的發生和發展機制提供新的理論依據。