減量增效套餐肥對洛川‘紅富士’蘋果品質和土壤多樣性影響的研究

吳小珍，郝祥蕊，宋 凱，崔 瑩，何亞文，張紅艷

（1.上海農樂生物制品股份有限公司，上海 201419；2.上海交通大學-上海農樂生物農藥與生物肥料聯合研發中心，上海 200240）

陜西省洛川縣屬于渭北黃土高原溝壑丘陵區，屬暖溫帶半濕潤大陸性季風氣候，具有涼爽干燥、土壤深厚、排水良好、陽光充足、晝夜溫差大的環境，適宜蘋果生長。根據國家統計局數據，截至2019年，我國蘋果總面積約為1.978×106hm2，總產量為4242.54萬t，占園林水果總產量的15.5%，陜西蘋果產量占我國蘋果總產量的26.8%[1]。洛川蘋果具有肉質細嫩致密、汁多松脆、酸甜適口等特征。根據農業品牌網2018年中國果品區域公用品牌價值評估結果，“洛川蘋果”的品牌價值以72.88億位于全國第三、陜西省第一，是陜西品牌價值最高的果品區域公用品牌。2019年1月17日，中華人民共和國農業農村部正式批準“洛川蘋果”實施國家農產品地理標志登記保護。截至2021年底，洛川縣蘋果種植面積超3.53×104hm2，年產蘋果95萬t，綜合產值突破百億元。

中國蘋果園養分管理中存在的問題主要表現在以下4個方面[2]：①土壤管理粗放，土壤障礙加重，根系生長不良；②建園條件差，有機肥投入不足，土壤有機質含量低；③化肥施用過量和不平衡，生理學病害普遍發生；④科學施肥技術普及率低，到位率低。李柳瑩等[3]通過對洛川北部、中部、南部三大區域的70個不同類型的果園的土壤進行調查研究顯示，洛川蘋果園土壤的平均有機質含量10.58 g·kg-1、全氮0.72 g·kg-1、有效磷9.28 mg·kg-1，速效鉀138.14 mg·kg-1，遠低于國內其他蘋果主產區。如河北省主要蘋果園有機質、土壤全氮、有效磷、速效鉀的平均含量分別為17.99 g·kg-1、1.16 g·kg-1、118.26 mg·kg-1、329.70 mg·kg-1[4]；運城市蘋果園土壤有機質、全氮、有效磷、速效鉀平均含量分別為1.13%、0.82 g·kg-1、33.47 mg·kg-1、210.80 mg·kg-1[5]。提高蘋果同土壤有機質含量、降低果園土壤pH值，合理施肥是當前洛川蘋果實現增產提質的關鍵。在可持續農業發展中，有機肥被認為是化學肥料的有效替代品。大量研究證明，有機肥替代化肥可以增加作物產量、改善作物品質、增加土壤有機質和土壤養分和提高微生物數量以及酶活性等[6-8]。

2015年農業部提出了到2020年實現化肥零增長的目標，通過優化施肥機構、改進施肥方式和推進精準施肥實現化肥的減量施用[9]。2017年農業部印發《開展果菜茶有機肥替代化肥行動方案》，將蘋果納為重點作物，大力推廣有機肥替代技術[10]。葛順峰等[11]提出要通過物化和簡化，形成周年營養套餐肥，實現蘋果化肥減施的目標。2017年1月，由上海市農委與洛川縣政府聯合推出：在洛川縣的4666.7 hm2蘋果種植園中實施“洛川蘋果雙減工程”，由上海農樂生物制品股份有限公司提供果樹標準化種植方案。果樹全程種植方案圍繞“綠色”“生態”“優質”“安全”制定，通過功能營養有機肥替代化學肥料，實現化學肥料減量，提升洛川蘋果的品質、改善土壤微環境。

套餐肥是以養分歸還學說、最小養分律、必需營養元素同等重要和不可替代律、肥料效應報酬遞減律和因子綜合作用律等作為理論依據[12]。融土壤養分檢測、肥料套餐配方、肥料加工、套餐效應田間試驗、效果檢驗評估、示范推廣服務為一體，將復雜的測土配方施肥技術物化為簡單的、方便農民使用的套餐肥在生產中推廣使用。本研究探討了農樂套餐對洛川‘紅富士’果實品質和土壤多樣性的影響。上海交通大學-上海農樂生物農藥和生物肥料聯合研發中心應用IlluminaHiSeq測序技術分析土壤細菌和真菌群落組成和多樣性，比較使用農樂套餐的地塊和常規施肥地塊的土壤化學性質、土壤微生物菌群的變化。以期系統地揭示農樂套餐對洛川蘋果園的土壤理化環境特征的影響，為蘋果的提質增效提供參考，為進一步優化套餐肥的設計提供科學依據，也為洛川蘋果綠色發展提供保障。

1 材料和方法

1.1 試驗區概況

試驗于2019—2020年在陜西洛川縣蘋果園進行。果園平均海拔1072 m，年平均氣溫9.5℃，年均降水量619 mm，無霜期達到167 d。供試蘋果品種為‘紅富士’，樹齡均為20年以上，行株距均為4 m×3 m。根據洛川地形，將洛川分為3個部分（洛川北塬、洛川中塬、洛川南塬），每部分選5片0.67 hm2以上果園。每果園選10～20個點，采用“S”形取土，同時記錄位置，便于來年取土跟蹤檢測；取土時間為采收后，施肥前。供試果園土壤類型為黃綿土，土壤有機質含量為10.58 g·kg-1，全氮0.72 g·kg-1，有效磷18.2 mg·kg-1，速效鉀201 mg·kg-1，土壤pH值8.18，質地為中壤，通透性強。

1.2 試驗方法

2019年11月12日選取長勢基本一致、無病蟲害的蘋果樹80株。用肥方案設置2個處理：處理1為農民常規套餐肥；處理2為農樂套餐肥。2個處理的具體用肥情況見表1，施肥按照少量多次的原則，果園其他日常管理均一致。處理1所涉及的肥料均為市售產品，施肥量為純氮598.5 kg·hm-2、P2O5384 kg·hm-2、K2O 660 kg·hm-2；處理2中所涉及的肥料由上海農樂生物制品股份有限公司提供，施肥量為純氮339.75 kg·hm-2、P2O5150.825 kg·hm-2、K2O 435 kg·hm-2。

表1 洛川‘紅富士’蘋果常規套餐肥和農樂套餐肥試驗方案

農樂套餐肥具有以下特點：（1）有機肥替代化肥，基肥中復合微生物肥替代復合肥，追肥中含腐植酸水溶肥替代大量元素水溶肥；（2）每公頃用肥總量減少28.28%，總養分減量43.65%，N、P2O5和K2O分別減量43.23%、60.72%和34.09%，每公頃用肥成本略低于常規套餐的用肥成本。

1.3 蘋果產量與品質測定

于2020年蘋果果實成熟期，在4個不同方位隨機采取樹體中部外圍果實，每個處理30個果，測定平均單果質量、可溶性固形物、可滴定酸、可溶性糖和維生素C含量。

每株樹測定單株產量，總產量為以每株樹的平均產量乘以單位面積棵數。單果質量用百分之一電子天平稱量；產量用電子秤稱量；果實縱橫徑使用數顯游標卡尺測定并計算果形指數和體積。

可溶性固形物含量用PAL-1型數顯式折射儀（日本Atago公司）測定；可滴定酸含量采用905型自動電位滴定儀[13]測定；可溶性糖含量采用3，5-二硝基水楊酸比色法[14]測定；維生素C含量（抗壞血酸）采用2，6-二氯靛酚滴定法[15]測定。

1.4 土壤樣品的采集與化學指標測定

在蘋果結果期采集根圍20 cm土壤表層以下5～10 cm樣品，采用五點取樣法，然后混合均勻作為每個重復小區的復合樣品。采集的土壤樣品于無菌袋密封保存并低溫運送至實驗室-80℃保藏備用。土樣風干后用于土壤pH值、土壤有機質、土壤全氮等指標的測定。

土壤pH值采用pH值計測定[16]；土壤有機質采用重鉻酸鉀法[17]測定；土壤全氮含量采用自動定氮儀法[18]測定；土壤有效磷含量采用碳酸氫鈉浸提—鉬銻抗比色法[19]測定；土壤速效鉀含量采用乙酸銨鹽交換法[20]測定。

1.5 土壤微生物多樣性分析

采集的土壤樣品送至派生諾生物科技股份有限公司開展微生物多樣性分析。DNA提取使用FastDNA試劑盒（MPBiomedicals，USA）提取。下述特異引物用于擴增相應土壤細菌16S rRNA基因V3-V4區域和真菌ITS基因（細菌：BAC-FOR：5′CCTAC GGGRSGCAGCAG-3′和BAC-REV：5′-GGACTAC VVGGGTATCTAATC-3′；真菌：FUN-FOR：5′-GCAT CGATGAAGAACGCAGC-3′和FUN-REV：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。擴增體系和擴增條件見KAPA HiFiHotstart Ready Mix試劑盒說明書。擴增子使用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒從2%瓊脂糖凝膠中提取，采用QubitdsDNA HS Assay Kit純化DNA。將純化的擴增子以等摩爾濃度合并，采用IlluminaMiseqTM測序平臺對群落DNA片段進行雙端（Paired-end）測序。采用PANDAseq軟件合并來自原始DNA片段的配對序列讀數。使用DADA2方法進行去引物、質量過濾、去噪、拼接和去嵌合體等步驟。使用DADA2質控后產生的每個去重的序列稱為ASVs(amplicon sequence variants)，或稱為特征序列(對應于OTU代表序列)，而這些序列在樣本中的豐度表稱為特征表(對應于OTU表)。詳細方案見Callahan等[21]。

1.6 數據處理與統計學方法

試驗數據處理與方差分析采用Microsoft Excel 2013和IBM SPSS 26.0軟件，圖表繪制采用Graph Pad Prism 8軟件。

2 結果與分析

2.1 常規套餐和農樂套餐管理的果園土壤化學性質比較

土壤障礙因子的改良與修復是促進農業可持續發展的關鍵，土壤有機質含量和酸堿度是評價土壤質量優劣的主要指標。為了關聯果實產量與品質提升與土壤肥力的關系，筆者系統分析了常規套餐和農樂套餐管理果園的土樣，結果表明，農樂套餐管理的果園土壤中的有效磷略稍有下降，但統計學上無顯著差異。但農樂套餐管理顯著提升土壤有機質含量16.8%、全氮含量13.3%和速效鉀含量34.9%，土壤pH值降低了1.3%（表2）。

表2 采用常規套餐和農樂套餐管理的蘋果園中0～20 cm深土壤肥力參數

2.2 常規套餐和農樂套餐對‘紅富士’蘋果的品質影響

由表3可知，相對于常規套餐，采用農樂套餐可以顯著提高株產量、單果質量、果形指數和著色面積，提升率分別為5.7%、7.2%、12.3%、6.0%（P＜0.05）；提高了蘋果中的可溶性固形物含量、維生素C含量和可溶性糖含量，提升率分別為8.0%、12.1%、11.1%；降低了蘋果中的可滴定酸的含量，降幅達7.1%。蘋果中可溶性糖是其甜度和風味品質的關鍵因素[22]，研究表明，蘋果中可溶性糖含量與其可溶性固形物含量之間呈極顯著正相關[23]，兩者均是決定水果風味的關鍵性因素[24]。農樂套餐的施用對改善洛川蘋果的品質具有顯著提升效果。

表3 采用常規套餐和農樂套餐管理對洛川‘紅富士’蘋果品質的影響

2.3 常規套餐和農樂套餐管理的果園中蘋果產量及經濟效益

農樂套餐為有機肥，使用后蘋果的品質有所提升，故其售價較高，使用常規套餐和農樂套餐采收后的蘋果銷售價格分別為4.6、4.8元·kg-1。通過計算，結果如表4所示，農樂套餐對蘋果的產量和經濟效益均有一定的提升，分別提高了5.69%、19.06%。這說明農樂套餐更能以較低的肥料成本投入獲得更高的收益回報。

表4 常規套餐和農樂套餐管理下果園的蘋果產量及經濟效益

2.4 土壤微生物Alpha多樣性分析

采用DADA2方法進行去引物、質量過濾、去噪、拼接和去嵌合體。利用質控后產生的每個去重的序列（ASV）水平分析不同套餐管理的果園微生物群落豐富度和多樣性。Alpha多樣性主要由下列3個指數體現：Chao1指數、Shannon指數和Simpson指數。土壤微生物測序分析得到的ASV值和體現Alpha多樣性的3個指數見表5。結果表明，采用農樂套餐管理的果園中細菌和真菌Alpha多樣性的3個指數平均值都高于常規套餐管理的果園；進一步統計學分析表明，2種模式管理果園中土壤微生物多樣性分析的3個指數具有顯著性差異。以上結果從宏觀角度說明農樂套餐管理可以顯著改善洛川果園土壤細菌和真菌的豐富度與多樣性。

表5 常規套餐和農樂套餐管理果園土壤微生物的豐富度和多樣性指數

2.5 常規套餐和農樂套餐管理的果園土壤細菌群落結構分析

圖1列出了2種套餐管理的果園中土壤細菌在門水平上的豐度變化。常規套餐管理的土壤中排名前9位的細菌屬分別為Proteobacteria(變形菌門)、Actinobacteria(放線菌門)、Gemmatimonadetes(芽單胞菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)、Chloroflexi(綠彎菌門)、Acidobacteria(酸桿菌門)、Deinococcus-Thermus(異常球菌-棲熱菌門)、Patescibacteria、Firmicutes(厚壁菌門)和Rokubacteria(己科河菌門)。農樂套餐管理導致放線菌門、綠彎菌門、酸桿菌門和己科河菌門的豐度顯著升高46%、22%、302%、1726%，其余菌門的豐度顯著降低20.5%～96%。

圖1 常規套餐和農樂套餐管理的果園土壤中細菌門水平組成和相對豐度

圖2列出了2種套餐管理的果園中土壤細菌在屬水平上的豐度變化。常規套餐管理的土壤中排名前14位的細菌屬分別為Luteibacter(藤黃色桿菌屬)、Woeseia、Truepera、Chujaibacter、Gemmatimonas(芽 單 胞 菌 屬)、Pseudomonas(假 單 胞 菌 屬)、Haliangium、Sphingomonas(鞘氨醇單胞菌)、TRA3-20、Nitrospira(硝化螺菌)、Pseudonocardia(假諾卡氏菌屬)、BIrii41、Rokubacteriales(羅庫菌)和Bacillus(芽孢桿菌屬)。農樂套餐管理對Haliangium屬細菌豐度影響不大，顯著降低藤黃色桿菌屬、Woeseia、Truepera、Chujaibacter、芽單胞菌屬細菌的豐度，顯著提高其他屬細菌的豐度70%～1726%。其中農樂套餐對藤黃色桿菌屬細菌的豐度影響最顯著，在常規套餐處理果園土壤中藤黃色桿菌屬是豐富對最高的屬，但在農樂套餐管理果園土壤中藤黃色桿菌屬幾乎檢測不到。

圖2 常規套餐和農樂套餐管理的果園土壤中細菌屬水平組成和相對豐度

2.6 常規套餐和農樂套餐管理的果園土壤真菌群落結構分析

常規管理果園土壤真菌主要是Ascomycota(子囊菌門)，其次還包括Rozellomycota(羅茲菌門)、Basidiomycota(擔子菌門)、Mortierellomycota(被孢霉菌門)和Mucoromycota(毛霉菌)等。農樂套餐管理降低子囊菌門真菌的豐度16%，幾乎完全消除了羅茲菌門真菌的分布（圖3）。羅茲菌門舊稱隱真菌門（Cryptomycota），是存在于土壤、淡水與海洋沉積物中的微生物，為真菌界最基群的演化支，是其他真菌界類群的姐妹群。農樂套餐管理還顯著提升擔子菌門、被孢霉菌門和毛霉菌門的豐度。

圖3 常規套餐和農樂套餐管理的果園土壤中真菌門水平組成和相對豐度

圖4列出了2種套餐管理的果園中土壤真菌在屬水平上的豐度變化。常規套餐管理的土壤中豐富度從大到小的真菌屬分別為Acaulium(無莖真菌屬)、Pseudogymnoascus(假裸囊菌屬)、Phialemonium、Fusarium(鐮刀菌屬)、Cephalotrichum(頭束霉屬)、Mortierella(被孢霉屬)、Tetracladium、Lophotrichus(瓶毛殼屬)、Alternaria(鏈格孢屬)、Acremonium(枝頂孢屬)和Mycoarthris。農樂套餐管理顯著降低無莖真菌屬、假裸囊菌屬、Phialemonium、頭束霉屬和Mycoarthris屬真菌的豐度，顯著提高其它屬細菌的豐度，對被孢霉屬、Tetracladium、瓶毛殼屬、鏈格孢屬和枝頂孢屬豐度的提升尤為明顯。在常規套餐處理果園土壤中Sistotrema屬、Tausonia屬和光黑殼屬真菌沒有檢測出來，但在農樂套餐管理果園土壤中這3個屬真菌豐度可以檢測到。

圖4 常規套餐和農樂套餐管理的果園土壤中真菌屬水平組成和相對豐度

3 結果與討論

本研究系統比較了采用常規套餐、農樂套餐管理后洛川蘋果園中果實產量、果實內外在品質、土壤生理生化特性和土壤微生物多樣性。結果表明，與常規套餐相比，農樂套餐處理（總養分減量43.65%）對洛川‘紅富士’蘋果產量提高了5.69%，且顯著提升了蘋果的品質，其中蘋果中的可溶性固形物含量、維生素C含量和可溶性糖含量，分別提高了8.0%、12.1%、11.1%，蘋果中的可滴定酸的含量降低了7.1%。此外，農樂套餐顯著降低土壤中藤黃色桿菌屬細菌的豐度，顯著提高假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌、硝化螺菌、假諾卡氏菌屬、羅庫菌和芽孢桿菌屬細菌的豐度。農樂套餐方案能有效提升果實產量和品質，這種提升與土壤理化性質和微生物多樣性改善密切相關。這些研究結果為進一步優化農樂套餐的設計提供了科學依據，也為洛川蘋果綠色發展提供了保障。

洛川是我國優質蘋果的主產區，也是蘋果科學用藥、施肥和管理研究的熱點區。李柳瑩等[3]系統研究了洛川蘋果園土壤的理化特征，發現土壤有機質含量偏低，pH值偏高，堿解氮、有效磷含量遠低于國內其他蘋果主產區。楊秀山等[25]通過科技小院對當地蘋果種植業施肥情況進行調查，結果發現秋施基肥普遍重視不夠，追肥王“一炮轟”中微量元素投入不合理；為追求產量，盲目提高施肥量。吳小杰等[26]探討了施用微生物復混肥與氮磷鉀復合肥對老齡園‘紅富士’蘋果產量及品質的影響。結果表明，與施用無機肥的對照組相比，施用微生物肥料的處理組各項指標均有提高，產量增幅為8.45%～22.86%；優果率提高15.76%；糖度提高3.05%；硬度提高2.86%。這些研究結果為洛川蘋果產量和品質提升提供了科學依據，但基本上還是研究單一因子或有限因子對果實品質和產量的影響，沒有綜合考慮多種藥肥組合和常年使用的套餐服務，對土壤微生物多樣性研究也涉及不多。

同常規套餐相比，農樂套餐基肥中復合微生物肥替代復合肥，追肥中含腐植酸水溶肥替代大量元素水溶肥；每公頃用肥總量減少28.28%，用肥成本略低于常規用肥成本。本研究中的農樂套餐包含多種有機肥、生物肥料等多種成分，評價指標包括果實產量、品質、土壤養分特征和土壤多樣性等。因此，本研究所得的結果應該更加科學，更有代表性，對蘋果種植更有指導意義。

土壤微生物多樣性是評價土壤健康的一個重要指標[27-28]。本研究比較了常規套餐和農樂套餐管理果園土壤細菌和真菌豐度和變化趨勢，洛川果園土壤細菌與真菌在門分類水平上與國內外其它果園研究結果相近[29-32]。本研究發現農樂套餐對土壤細菌與真菌在屬分類水平方面的豐度和分布存在前人未報道過的現象，如：農樂套餐顯著降低土壤中藤黃色桿菌屬細菌的豐度，而顯著提高假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌、硝化螺菌、假諾卡氏菌屬、羅庫菌和芽孢桿菌屬細菌的豐度。藤黃色桿菌屬細菌屬于革蘭氏陰性好氧菌，是土壤中常見微生物，具有降解和促進植物生長功能[33]。假單胞菌屬和芽孢桿菌屬細菌是典型土壤植物根際微生物，它們在植物生長發育和抗病性等方面均發揮了重要功能[34]。這些現象是農樂套餐所獨有的功效還是具有普遍性規律需進一步調查。如果屬實，其可能的機制值得進一步探討。